Введение в вирусологию Вирусология как наука Известные ученые-вирусологи

Введение в вирусологию. Вирусология как наука. Известные ученые-вирусологи. Этапы развития вирусологии.

Вирусология – наука о вирусах – микроскопических надмолекулярных созданиях природы, которые являются своеобразной паразитической формой жизни. Общая вирусология изучает природу вирусов, их строение, размножение, биохимию, генетику. Медицинская, ветеринарная и сельскохозяйственная вирусология исследует патогенные вирусы, их инфекционные свойства, разрабатывает меры предупреждения, диагностики и лечения вызываемых ими заболеваний.
Первое экспериментальное доказательство существования новой группы возбудителей инфекционных заболеваний было получено Д. И. Ивановским в 1982 г. при изучении мозаичных заболеваний табака. С этого момента начался первый этап развития вирусологии. В этот период были разработаны методы выделения, накопления и идентификации вирусов с использованием в качестве основной модели изучения лабораторных животных. В 40-е годы благодаря исследованиям Ф. М. Бернета в вирусологию в качестве экспериментальной модели входят куриные эмбрионы в связи с их высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы и др. Открытие в 1941 г. американским вирусологом Херстом феномена гемагглютинации способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой на модели вируса гриппа и эритроцитов.
Второй период – становление вирусологии, характеризуется открытием основных групп вирусов. Большим вкладом отечественных вирусологов (JI. А. Зильбером, А. А. Смородинцевым, М. П. Чумаковым, В. Д. Соловьевым и др.) в медицинскую вирусологию явилось изучение природно-очаговых заболеваний – эпидемических энцефалитов.
Третий период – клеточный, берет начало с 50-х годов. В 1952 г. Дж. Эндерс, Т. Уэллер, Ф. Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Использование культуры клеток в вирусологии послужило основой для выделения многочисленных новых вирусов, их идентификации, клонирования, изучения их взаимодействия с клеткой. Появилась возможность получения культуральных вакцин. Вместе с американскими вирусологами Дж. Солком и А. Сейбином, советскими вирусологами М. П. Чумаковым, А. А. Смородинцевым и др. была разработана технология производства, апробирована и внедрена в практику убитая и живая вакцины против полиомиелита. В 1963 г. за разработку и внедрение в практику живой полиомиелитной вакцины им была присуждена Ленинская премия. Другим важным приложением техники выращивания вирусов явилось получение Дж. Эццерсом и А. А. Смородинцевым живой коревой вакцины, широкое применение которой обусловило значительное снижение заболеваемости корью в стране.
Четвертый уровень – молекулярный с 60-х годов ХХ ст. Стали широко использоваться методы молекулярной биологии, а вирусы благодаря простой организации их генома стали распространенной моделью для молекулярной биологии. Все это позволило установить принципы строения (архитектуры) вирионов, способы проникновения вирусов в клетку и их репродукции.
Субмолекулярный уровень (70-е годы). Стремительное развитие молекулярной биологии открывает возможности изучения первичной структуры нуклеиновых кислот и белков. Появляются методы секвенирования ДНК, определения аминокислотных последовательностей белка. Получают первые генетические карты геномов ДНК-содержащих вирусов.
В 1970 г. Д. Балтимором и одновременно Г. Теминым и С. Мизутани была открыта обратная транскриптаза в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов, фермент, переписывающий РНК на ДНК. Становится реальным синтез гена с помощью этого фермента на матрице, выделенной из полисом иРНК. Появляется возможность переписать РНК в ДНК и провести ее секвенирование.
В 1972 г. возникает новый раздел молекулярной биологии — генная инженерия. В этом году публикуется сообщение П. Берга в США о создании рекомбинантной молекулы ДНК, которое положило начало эре генной инженерии. Появляется возможность получения большого количества нуклеиновых кислот и белков путем введения рекомбинантных ДНК в состав генома прокариот и простых эукариот. Одним из основных практических приложений нового метода является получение дешевых препаратов белков, имеющих значение в медицине (инсулин, интерферон) и сельском хозяйстве (дешевые белковые корма для скота).
Установлены причины регулярно повторяющихся пандемий гриппа. Детально изучены вирусы рака животных (птиц, грызунов), установлена структура их генома и идентифицирован ген, ответственный за злокачественную трансформацию клеток — онкоген. Установлена вирусная этиология гепатитов А и В. В 1976 г. Г. Бламберг, исследуя антигены крови у аборигенов Австралии, обнаружил так называемый австралийский антиген – антиген гепатита В. За это открытие Г. Бламбергу в 1976 г. была присуждена Нобелевская премия.
Другая Нобелевская премия в 1976 г. присуждена американскому ученому К. Гайдушеку, который установил вирусную этиологию, одной из медленных инфекций человека — куру, наблюдающейся в одном из туземных племен на острове Новая Гвинея.

Вирус: строение и хим. состав, функции структур вириона. Отличие от других агентов. Формы существования вирусов.

В онтогенетическом цикле вируса выделены две стадии – внеклеточная и внутриклеточная и, соответственно, две формы его существования – вирион и вегетативная форма. Вирион — это целая вирусная частица, в основном состоящая из белка и нуклеиновой кислоты, часто устойчивая к воздействию факторов внешней среды и приспособленная для переноса генетической информации из клетки в клетку. Вегетативная форма вируса существует в едином комплексе вирус-клетка и только в их тесном взаимодействии.
Вирусы обладают скрытой инфекциозностью. Патогенность проявляется только у вирионных нуклеиновых кислот и лишь тогда, когда они проникают в клетку, где и представляют собой внутриклеточную, или репродуцирующуюся форму существования вирусов, тесно связанную с ее метаболизмом и генетическим аппаратом.
Структурная организация вирионов очень проста. Они не имеют обычной для клеток цитоплазмы и ядра, митохондрий и рибосом, других органелл, а у многих вирионов отсутствуют даже ферменты. Они представляют собой нуклеокапсид – нуклеиновая кислота, заключенная в белковую оболочку. Сателлиты, вироиды, дефектные вирусы и прионы также относят к царству Вира, но от типичных вирусов они несколько отличаются и по структуре, и по особенностям репродукции. Дефектные вирусы репродуцируются либо в присутствии полноценных вирусов либо для репродукции используют белки вируса-помощника. Сателлиты – группа вирусоподобных организмов, которые всегда дефектны по репликации и являются спутниками полноценных, не родственных им вирусов (паразитизм вирусов на вирусах). Вироиды – представляют собой небольшую кольцевую молекулу РНК и не содержат ни капсида, ни оболочки. Прионы – частицы, состоящие только из белка и не имеющие нуклеиновой кислоты.
Различают простые и сложные вирионы. Простые состоят из нуклеиновой кислоты, окруженной снаружи белковой оболочкой, которую называют капсидом, сложные – имеют дополнительную внешнюю оболочку (суперкапсид, пеплос).
Структура и химический состав простых вирионов. В состав простых вирусов, типичным представителем которых является вирус табачной мозаики, входят только капсидные белки, но у некоторых из них содержатся также геномные, или терминальные, ковалентно связанные с концом вирионной нуклеиновой кислоты и участвующие в регуляции вирусного генома.
Капсидные белки простоорганизованных вирионов обычно состоят из 1-3 вирусоспецифических белков (полипептидных цепей). При этом каждый из них обладает способностью к самосборке, в начале которой из идентичных полипептидных цепей образуются отдельные структурные элементы (субъединицы) или капсомеры белкового чехла, вслед за чем при их взаимодействии с нуклеиновой кислотой вириона происходит полное самопроизвольное формирование капсида. Количество капсомеров в капсиде вирусов варьирует от трех-шести десятков до многих сотен. У одних вирусов капсомеры имеют овальную или округлую форму, у других — пяти- или шестигранную.
По характеру расположения капсомеров вирусы делят на три группы: с кубическим, спиральным и смешанным типом симметрии. Большинство патогенных для человека вирусов имеет кубический тип симметрии. Спиральный тип симметрии нередко встречается среди вирусов растений. Смешанный тип симметрии для простых вирусов нетипичен.
Структура и химический состав сложных вирионов. Сложно устроенные вирусы в капсиде имеют много разновидностей белков. Кроме капсидных и геномных белков могут также содержать ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусного генома, например ДНК- и РНК-полимеразы. Формирование их капсидов и нуклеокапсидов происходит тоже в процессе самопроизвольной сборки, но цикл полного образования сложных вирионов носит многоступенчатый характер.
В суперкапсиде сложных вирусов, представляющем собой липидный бислой, в котором расположены пепломеры, превалируют гликопротеиды. Являясь типичными внутримембранными белками, они у большинства вирусов образуют поверхностные «шипы», длина которых достигает 5-10 нм. Чаще всего шипы построены из нескольких молекул идентичного белка, и те вирусы, которые имеют один гликопротеид, естественно, обладают одним типом шипов, при наличии в них двух гликопротеидов — двумя типами. Есть, однако, вирусы, имеющие 2-3 гликопротеида, формирующие один тип шипов.
Суперкапсидные вирусные гликопротеиды выполняют две основные функции: 1) распознают специфические клеточные рецепторы и взаимодействуют с ними, что дало повод называть их прикрепительными белками, и 2) обусловливают проникновение вируса в клетки, инициируя слияние его оболочек с клеточными мембранами, вследствие чего их называют белками слияния.
Количество углеводов в гликопротеидах может достигать 10% общей массы вириона. Обычными сахарными остатками в них являются сахароза, фруктоза, манноза, галактоза, нейраминовая кислота. Углеводы гликопротеидов обеспечивают сохранение конформации белка и его устойчивость к протеазам.
Содержание липидов в липидном бислое суперкапсида у сложных РНК-содержащих вирионов может составлять от 15 до 35% их сухой массы. Большая часть из них представлена фосфолипидами (50-60%) и холестерином (20-30%). Липиды, как и углеводы, тоже стабилизаторы, обеспечивающие целостность структуры вириона.
Нуклеиновые кислоты вирусов. Независимо от сложности строения вирусов нуклеиновая кислота в нуклеокапсидах представлена одной из ее разновидностей — ДНК или РНК и никогда вместе взятыми. Каждая из них является геномом. В разных по величине вирионах в геноме насчитывают от нескольких до многих десятков генов.
Геномные нуклеиновые кислоты вирусов отличаются от клеточных необычайным разнообразием структуры и формы. Так, вирусные ДНК могут иметь не только двухцепочечную, но и одноцепочечную цельную структуру или же «разрыв-дефект» в одной цепи, а по форме, кроме обычной линейной, — циркулярно-замкнутую (кольцевую). В еще большей степени различаются вирусные РНК: одно- и двухцепочечные; цельные (сплошные) и фрагментированные на 2-3 … 8-12 сегментов; линейные и кольцевые, как у вирусных ДНК.
Геном вируса является гаплоидным, т. е. представлен одним набором генов. Частично диплоидны ДНК-содержащие вирусы, в ДНК которых встречаются повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Полностью диплоидны ретровирусы, геном которых представлен двумя идентичными молекулами РНК, на матрице которых формируются ДНК-транскрипты.
Вследствие большого разнообразия геномов вирусов генетическая информация у них реализуется в нескольких направлениях: 1) ДНК —> иРНК —> белок (как в клетках); 2) РНК —> белок (позитивный геном); 3) РНК —> иРНК —> белок (негативный геном); 4) РНК —> ДНК —> иРНК —> белок (позитивный геном с наличием обратной транскриптазы); 5) одноцепочечная ДНК —> промежуточный двух цепочечный ДНК-транскрипт иРНК —> белок у парвовирусов.

Характеристика белков вирусов: строение и функции структурных белков.

Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнаружены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета — актин, и ядерные белки — гистоны.
По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделяют на две группы: структурные и неструктурные. Структурные белки — это белки, входящие в состав капсида вируса, их обозначают как VP.
Структурные белки делятся на 2 группы:
капсидные белки, образующие капсид, т. е. футляр для нуклеиновой кислоты вируса, и входящие в состав капсида геномные белки, и ферменты;
суперкапсидные белки, входящие в состав суперкапсида, т. е. наружной вирусной оболочки. Поскольку суперкапсид называют также «пеплос», эти белки называют пепломерами.
Просто организованные вирусы, представляющие собой нуклеокапсид, содержат только капсидные белки. Сложно организованные вирусы содержат капсидные и суперкапсидные белки.
Капсидные белки. Хотя основной функцией капсидных белков является функция защиты вирусного генома от неблагоприятных воздействий внешней среды, у многих вирусов в составе капсида есть белки и с другими функциями.
Основным принципом строения капсидной оболочки вирусов является принцип субьединичности, т. е. построение капсидной оболочки из субъединиц-капсомеров, образованных идентичными полипептидными цепями. Правильно построенные белковые субъединицы — капсомеры возникают благодаря способности вирусных капсидных белков к самосборке. Самосборка объясняется тем, что упорядоченная структура — капсид имеет наименьшую свободную энергию по сравнению с неупорядоченными белковыми молекулами. Сборка капсидной оболочки из субъединиц запрограммирована в первичной структуре белка и происходит самопроизвольно или при взаимодействии с нуклеиновой кислотой.
Сборка сложно организованных вирусов является гораздо более сложным многоступенчатым процессом, хотя отдельные ее этапы, например формирование капсидов и нукдеокапсидов, также основаны на самосборке.
Суперкапсидные белки. Гликопротеиды. Суперкапсидные белки, или пепломеры, располагаются в липопротеидной оболочке (суперкапсиде или пеплосе) сложно устроенных вирусов. Они либо пронизывают насквозь липидный бислой как, например, гликопротеиды альфа-вирусов, либо не доходят до внутренней поверхности. Эти белки являются типичными внутримембранными белками и имеют много общего с клеточными мембранными белками. Как и последние, суперкапсидные белки обычно гликозилированы. Углеводные цепочки прикреплены к молекуле полипептида в определенных участках. Гликозилирование осуществляют клеточные ферменты, поэтому один и тот же вирус, продуцируемый разными видами клеток, может иметь разные углеводные остатки: может варьировать как состав углеводов, так и длина углеводной цепочки и место прикрепления ее к полипептидному остову.
У большинства вирусов гликопротеиды формируют «шипы» на поверхности вирусной частицы, длина которых достигает 7—10 нм. Шипы представляют собой морфологические субъединицы, построенные из нескольких молекул одного и того же белка. Гликопротеиды являются амфипатическими молекулами: они состоят из наружной, гидрофильной части, которая содержит на конце аминогруппу (N-конец), и погруженной в липидный бислой, гидрофобной части, которая содержит на погруженном конце гидроксильную группу (С-конец). С-концом полипетид «заякоривается» в липидном бислое.
Основной функцией гликопротеидов является взаимодействие со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Благодаря этим белкам осуществляется распознавание специфических клеточных рецепторов и прикрепление к ним вирусной частицы, т. е. адсорбция вируса на клетке. Поэтому гликопротеиды, выполняющие эту функцию, называют вирусными прикрепительными белками.
Другой функцией гликопротеидов является участие в слиянии вирусной и клеточной мембран, т. е. в событии, ведущем к проникновению вирусных частиц в клетку. Вирусные белки слияния ответственны за такие процессы, как гемолиз и слияние плазматических мембран соседних клеток, приводящие к образованию гигантских клеток, синцитиев и симпластов.
«Адресная функция» вирусных белков. Вирусы вызывают инфекционный процесс у относительно небольшого круга хозяев. Вирус должен «узнать» чувствительную клетку, которая сможет обеспечить продукцию полноценного вирусного потомства. Если бы вирус проникал в любую клетку, которая встретилась на его пути, это привело бы к исчезновению вирусов в результате деструкции «родительской» вирусной частицы и отсутствия вирусного потомства. В процессе эволюции у вирусов вырабатывалась так называемая адресная функция, т. е. поиск чувствительного хозяина среди бесконечного числа нечувствительных клеток. Эта функция реализуется путем наличия специальных белков на поверхности вирусной частицы, которые узнают специфический рецептор на поверхности чувствительной клетки.

Характеристика белков вирусов: строение и функции неструктурных белков.

Неструктурные белки — это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ.
Вирусные белки-ферменты могут входить в состав вирусной частицы или являться неструктурными белками и появляться в клетке после экспрессии вирусного генома. Наиболее оснащенным ферментами является вирион вируса оспы, который имеет практически полный набор энзимов, необходимых для независимой внутриклеточной репликации вируса. В то же время, мелкие просто организованные изометрические вирусы с позитивным РНК-геномом могут не иметь никаких ферментов в составе вириона.
Функционально активные белки вирусов представлены:
ферментами нуклеинового обмена, обеспечивающими сложные механизмы репликации/транскрипции вирусного генома.
ферментами, осуществляющими посттрансляционный процессинг и модификацию белков;
ферментами, участвующими в проникновении вирионов в клетку хозяина.
Первая и вторая группа ферментов наиболее многочисленна и включает как аналоги клеточных ферментов, так и вирус-специфические ферменты.
ДНК-зависимая ДНК-полимераза — осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК (вирус оспы).
ДНК-зависимая РНК-полимераза — осуществляет синтез мРНК на матрице ДНК (вирус оспы).
РНК-зависимая РНК-полимераза — осуществляет синтез РНК на матрице РНК. Выполняет функции транскриптазы и репликазы. Впервые обнаружена в 1970 г. Балтимором у вируса везикулярного стоматита. Входит в состав вирионов или является NS-белком РНК-содержащих вирусов.
Обратная транскриптаза или ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице РНК. Впервые открыта в 1970 г. у ретровирусов Темином и Мизутани.
Хеликаза — осуществляет расплетете двухнитевой структуры ДНК. Кроме этого хеликазы обладают нуклеотидтрифосфат-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая включает три процесса: связывание дезоксинуклеотидтрифосфата, его гидролиз и за счет этой энергии расплетение двухнитевой РНК.
мРНК-модифицирующие ферменты: поли-А-полимераза — аденилирует 3′-конец РНК за счет энергии АТФ; Кэп-энзим и метилтрансферазный комплекс — катализирует образование на 5′-конце кэп-структуры.
Рибонуклеаза Н — разрушает РНК, находящуюся в дуплексе с ДНК. Вторая группа вирусных ферментов — ферменты белкового обмена.
Протеиназы — ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге полипротеинов. Являются NS-белками РНК-содержащих вирусов;
Протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие структурные белки вирионов. Обнаружены в составе вируса везикулярного стоматита, вируса бешенства, альфавирусов и ретровирусов.
Третья группа представлена ферментами, участвующими в проникновении вирусов в клетку. К ним относятся: лизоцим бактериофагов, нейраминидаза вируса гриппа. Кроме того, у вирусов есть АТФ-аза, ГТФ-аза, которые осуществляют гидролиз соответствующих энергетических субстратов.

Нуклеиновые кислоты вирусов. Их структура и функции.

Независимо от сложности строения вирусов нуклеиновая кислота в нуклеокапсидах представлена одной из ее разновидностей – ДНК или РНК и никогда вместе взятыми. Каждая из них является геномом. В разных по величине вирионах в геноме насчитывают от нескольких до многих десятков генов.
Геномные нуклеиновые кислоты вирусов отличаются от клеточных необычайным разнообразием структуры и формы. Так, вирусные ДНК могут иметь не только двухцепочечную, но и одноцепочечную цельную структуру или же «разрыв-дефект» в одной цепи, а по форме, кроме обычной линейной, — циркулярно-замкнутую (кольцевую). В еще большей степени различаются вирусные РНК: одно- и двухцепочечные; цельные (сплошные) и фрагментированные на 2-3 … 8-12 сегментов; линейные и кольцевые, как у вирусных ДНК.
У вирусов, геном которых представлен двухцепочечной ДНК, механизм ее репликации обеспечивается ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Считается, что у кольцевых форм вирусных ДНК способ репликации более эффективен, чем у линейных. Они устойчивее к клеточным эндонуклеазам и, вероятно, потому вирусные ДНК через кольцевые стадии интегрируют с клеточным геномом.
Среди РНК-содержащих вирусов с одноцепочечным линейным типом нуклеиновой кислоты различают вирусы с позитивным и негативным геномом.
У вирусов с позитивным геномом РНК обладает функцией информационной, т. е. одновременно служит матрицей для синтеза вновь образующихся вирионных РНК и белков. Линейные вирусные РНК со свойствами иРНК принято обозначать знаком «плюс», а вирусы, их содержащие, называть «плюс-нитевыми».
У вирусов с негатив ным геномом РНК не обладает информационной функцией, вследствие чего ее обозначают знаком «минус», а вирусы называют «минус-нитевыми». Синтез иРНК у такого рода вирусов осуществляется в зараженной клетке на матрице минус-РНК с помощью вирусоспецифического фермента транскриптазы.
Некоторые РНК-содержащие вирусы могут являться амбисенсвирусами и содержать как «плюс», так и «минус» нити РНК.
Особым свойством обладает геномная РНК так называемых ретровирусов, имеющих в своем составе реверсальную (обратную) транскриптазу, или РНК-зависимую ДНК-полимеразу. С помощью этого уникального вирусспецифического фермента на ее матричной основе последовательно синтезируются вначале одна нить ДНК, затем и другая, которые, замкнувшись в кольцо, интегрируют с клеточным геномом, после чего с участием РНК- полимеразы клеток происходит переписывание информации на РНК. Поскольку синтезированная таким окольным путем иРНК не просто комплементарна геномной, как у минус-нитевых вирусов, а полностью гомологична ей, то ретровирусы с полным правом относят к «плюс-нитевым».
Исходя из структурно-функциональной организации генома вирусов, можно сказать, что геном вируса является гаплоидным, т. е. представлен одним набором генов. Частично диплоидны ДНК-содержащие вирусы, в ДНК которых встречаются повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Полностью диплоидны ретровирусы, геном которых представлен двумя идентичными молекулами РНК, на матрице которых формируются ДНК-транскрипты (копии).
Число генов в вирусных геномах колеблется от 3-4 у самых простых вирусов до многих десятков у сложно устроенных. ДНК-содержащие вирусы так же, как про- и эукариоты, имеют структурные гены, кодирующие белки-ферменты, и регуляторные гены, детерминирующие образование репрессоров, подавляющих, в частности, функцию структурных. Считывание информации с оперонов контролируется энхансером или усилителем транскрипции; промотором, ответственным за ее инициацию (начало), с которым связывается фермент РНК-полимераза, осуществляющая транскрипцию ДНК; оператором, регулирующим транскрипцию оперона (или отдельных генов) и терминатором, прекращающим ее. При этом регуляторные участки оперона представляют собой короткие последовательности нуклеотидов ДНК; энхансер, промотор и оператор расположены в его начале (перед структурными генами), а терминатор — в конце.
В структурных генах вирусных оперонов, как и в клетках эу- кариот, имеются кодируемые участки нуклеотидных последовательностей, несущих информацию (экзоны), и некодируемые вставочные последовательности (интроны), которые после транскрипции в процессе созревания (процессинга) иРНК вырезаются с одновременным считыванием экзонов, что называется сплайсингом. Сплайсинг при формировании зрелых иРНК отмечается чаще всего среди вирусов, имеющих ядерную локализацию транскрипции, поскольку ферменты, осуществляющие его, находятся в ядре.
Вирусные иРНК в отличие от иРНК про- и эукариот могут направлять синтез не одного, а двух-трех белков, что позволяет им при минимальном содержании генетического материала увеличивать генетическую информацию.
При сдвиге рамки считывания на один или два нуклеотида и появлении нового генетического кода молекула иРНК может транслироваться с образованием таких полипептидов, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей, вследствие чего их называют уникальными белками.
Нередким способом увеличения генетической информации у вирусов является трансляция гигантских полипептидов-предшественников с последующим нарезанием их на более мелкие.
И, наконец, относительно невысокий, как некоторые полагают, уровень генетической информации вирусов компенсируется исключительно точным механизмом переключения с репликации на транскрипцию и наоборот, что особенно ярко проявляется при репродукции РНК-содержащих вирусов.
Геном вируса является гаплоидным, т. е. представлен одним набором генов. Частично диплоидны ДНК-содержащие вирусы, в ДНК которых встречаются повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Полностью диплоидны ретровирусы, геном которых представлен двумя идентичными молекулами РНК, на матрице которых формируются ДНК-транскрипты.
Вследствие большого разнообразия геномов вирусов генетическая информация у них реализуется в нескольких направлениях: 1) ДНК —> иРНК —> белок (как в клетках); 2) РНК —> белок (позитивный геном); 3) РНК —> иРНК —> белок (негативный геном); 4) РНК —> ДНК —> иРНК —> белок (позитивный геном с наличием обратной транскриптазы); 5) одноцепочечная ДНК —> промежуточный двухцепочечный ДНК-транскрипт иРНК —> белок у парвовирусов.

Таксономия вирусов. Основные критерии вирусов для их систематики. Основные таксоны. Правила номенклатуры таксонов вирусов.

Современная классификация вирусов является универсальной для всех организмов. В ее основе лежит совокупность главных признаков – свойств (критериев), характеризующих тот или иной вирус с разных сторон.
Вот основные критерии современной классификации:
1) морфология вирионов;
2) тип нуклеиновой кислоты и стратегия репликации;
3) круг восприимчивых хозяев;
4) патогенность;
5) географическое распространение;
6) способ передачи;
7) антигенные свойства.
Все перечисленные признаки (критерии) и их сочетание формируют иерархические уровни (таксоны) современной универсальной системы классификации: порядки, семейства, подсемейства, роды и виды.
Универсальная система вирусной классификации должна иметь иерархические уровни: Порядок, Семейство, Подсемейство, Род, Вид.
Самый низший таксон в иерархической системе вирусов – вид, самый высший – порядок. Как правило, виды объединяются в роды, роды в подсемейства, подсемейства в семейства, а семейства в порядки. Но в классификации того или иного вируса не всегда будут использоваться все иерархические уровни, т.е. какой-либо из таксонов может отсутствовать. Бывает, что виды вирусов могут не объединяться в род, а будут на основании каких-либо общих признаков сразу относится к семейству.
Пример, полной и неполной классификации.
Полная: вид Mumps virus; род Rubulavirus; подсемейство Paramyxovirinae; семейство Paramyxoviridae; порядок Mononegavirales.
Неполная: вид Poliovirus; род Enterovirus; семейство Picornaviridae
Правила номенклатуры таксонов
Видовое название состоит, как правило, из двух-трех слов, производных от названий вышестоящих таксонов. В видовом названии не должно звучать только лишь название хозяина или слово «вирус». Принципы создания видовых названий вирусов – объектов разных областей вирусологии, различны. Например, для видовых названий вирусов растений часто используется конструкция «хозяин-симптом-вирус» (например, вирус некроза табака), или видовые названия вирусов позвоночных – от географического месторасположения, например, вирус Марбург, Буньямвирус и др. Название рода должно быть единичным словом, заканчивающимся на «virus», подсемейство – на «virinae», семейство – на «viridae», порядок – на «virales».

7. Вид вируса: определение, критерии, номенклатура.

Вид – это совокупность вирусных единиц, которые воспроизводятся в ряду поколений и занимают определенную экологическую нишу. Видовое название состоит, как правило, из двух-трех слов, производных от названий вышестоящих таксонов. В видовом названии не должно звучать только лишь название хозяина или слово «вирус». Принципы создания видовых названий вирусов – объектов разлных областей вирусологии, различны. Например, для видовых названий вирусов растений часто используется конструкция «хозяин-симптом-вирус» (например, вирус некроза табака), или видовые названия вирусов позвоночных – от географического месторасположения, например, вирус Марбург, Буньямвирус и др.
Критерии вида: антигенные свойства; патогенность, в т.ч. цитопатические изменения в клетках и внутриклеточные включения; круг восприимчивых хозяев; способ передачи; географическое распространение

8. Род вируса: определение, критерии, номенклатура.

Род – группа видов, объединенных общими свойствами. Название рода должно быть единичным словом, заканчивающимся на «virus». Например, род Mastadenovirus, род Aviadenovirus
Критерии рода: размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров; наличие липопротеидной оболочки; физико-химические свойства (устойчивость к температурам, рН среды, жирорастворителям и т.д.).

9. Семейство вируса: определение, критерии, номенклатура.

Семейство – группа родов (или подсемейств), объединенных определенными общими свойствами. Название семейства должно быть единичным словом, заканчивающимся на «viridae». Например: семейство Adenoviridae, семейство Herpesviridae.
Критерии семейства: тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и ее структура, количество цепей: односпиральная или двуспиральная; форма цепей: линейная или кольцевая; непрерывная или сегментированная; тратегия вирусного генома (способ репродукции по классификации
Балтимора).

10. Характеристика этапов репродукции вируса. Способы проникновения вирусов в клетку.

Этапы взаимодействия вируса с клеткой.
1. Адсорбция вириона на поверхности клетки.
— это происходит спонтанно и не специфически за счет электростатического притяжения аминных групп вируса (+) и кислофосфатных групп клетки (-).
— специфический механизм, за счет комплементарных связей клеточных и вирусных рецепторов (липопротеиновых и мукопротеиновых).
2. Проникновение вируса в клетку
3. Депротеинизация вируса – высвобождение вирусного генома. Вирусная частица частично разбирается на отдельные капсомеры.
4. Синтез «ранних» вирусных белков. Подавляющий синтез клеточных макромолекул, обеспечивающих репликацию вирусной НК.
5. Репликация вирусной РНК. Латентный период – врямя от адсорбции до начала получения отдельных белков.
6. Синтез вирусных структурных «поздних» белков.
7. Сборка вируса – ассамблизация
— образование нуклеокапсидов
— организация вирусной мембраны.
6. Выход зрелых вирусных частиц за пределы клетки.
Проникновение вируса в клетку – это этап репродукции, следующий за процессом адсорбции. Исторически сложилось представление о двух альтернативных механизмах проникновения в клетку вирусов животных – путем виропексиса (эндоцитоза) и путем слияния вирусной и клеточной мембран. Однако оба эти механизма не исключают, а дополняют друг друга. Термин «виропексис», предложенный в 1948 г. Фазекасом де сан Гро, означает, что вирусная частица попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка плазматической мембраны и образования вакуоли, которая содержит вирусную частицу.
Рецепторный эндоцитоз. Виропексис представляет собой частный случай рецепторного или адсорбционного эндоцитоза. Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки, покрытые со стороны цитоплазмы особым белком с большой молекулярной массой — клатрином. На дне ямки располагаются специфические рецепторы. Ямки обеспечивают быструю инвагинацию и образование покрытых клатрином внутриклеточных вакуолей. Таким образом, рецепторный эндоцитоз представляет собой хорошо слаженный механизм, который обеспечивает быстрое проникновение в клетку чужеродных веществ. Покрытые вакуоли сливаются с другими, более крупными цитоплазматическими вакуолями, образуя рецепто- сомы, содержащие рецепторы, но не содержащие клатрин, а те в свою очередь сливаются с лизосомами. Таким путем проникшие в клетку белки обычно транспортируются в лизосомы, где происходит их распад на аминокислоты; они могут и миновать лизосомы, и накапливаться в других участках клетки в недеградированной форме. Альтернативой рецепторного эндоцитоза является жидкостный эндоцитоз, когда инвагинация происходит не в специализированных участках мембраны. Большинство оболочечных и безоболочечных вирусов животных проникает в клетку по механизму рецепторного эндоцитоза. Эндоцитоз обеспечивает внутриклеточный транспорт вирусной частицы в составе эндоцитарной вакуоли, поскольку вакуоль может двигаться в любом направлении и сливаться с клеточными мембранами (включая ядерную мембрану), освобождая вирусную частицу в соответствующих внутриклеточных участках. Таким путем, например, ядерные вирусы попадают в ядро, а реовирусы — в лизосомы. Однако проникшие в клетку вирусные частицы находятся в составе вакуоли и отделены от цитоплазмы ее стенками. Им предстоит пройти ряд этапов, прежде чем они смогут вызвать инфекционный процесс.
Слияние вирусной и клеточной мембран. Для того чтобы внутренний компонент вируса мог пройти через клеточную мембрану, вирус использует механизм слияния мембран. У оболочечных вирусов слияние обусловлено точечным взаимодействием вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны, в результате которого вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса оказывается по другую ее сторону. У безоболочечных вирусов один из поверхностных белков также взаимодействует с липидами клеточных мембран, в результате чего внутренний компонент проходит через мембрану. Большинство вирусов животных выходит в цитозоль из рецептосомы.
Если при эндоцитозе вирусная частица является пассивным пассажиром, то при слиянии она становится активным участником процесса. Белком слияния является один из ее поверхностных белков. К настоящему времени этот белок идентифицирован лишь у парамиксовирусов и ортомиксовирусов. У парамиксовирусов этот белок (F-белок) представляет собой один из двух гликопротеидов, находящихся на поверхности вирусной частицы.

11. Характеристика этапов репродукции вируса. Способы ассамблирования вирусной частицы и выхода вируса из клетки.

Сборка вирусов (ассамблирование). Синтез компонентов вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Вирусы, репликация которых проходит в ядрах, условно называют ядерными. В основном это ДНК-содержащие вирусы: адено-, папова-, парвовирусы, вирусы герпеса. Вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме, называют цитоплазматическими. К ним относятся из ДНК-содержащих вирус оспы и большинство РНК-содержащих вирусов, за исключением ортомиксо- и ретровирусов. Однако это разделение весьма относительно, потому что в репродукции тех и других вирусов есть стадии, протекающие соответственно в цитоплазме и ядре.
Внутри ядра и цитоплазмы синтез вирусспецифических молекул также может быть разобщен. Так, например, синтез одних белков осуществляется на свободных полисомах, а других – на полисомах, связанных с мембранами. В основе самосборки лежит специфическое белок-нуклеиновое и белок-белковое узнавание, которое может происходить в результате гидрофобных ионных и водородных связей, а также стерического соответствия. С этого узнавания участка генома вирусными капсидными белками начинается процесс сборки вирусной частицы. Присоединение остальных белковых молекул осуществляется за счет специфических белок-белковых взаимодействий или неспецифических белок-нуклеиновых взаимодействий.
Объединение белка с вирусными нуклеиновыми кислотами в клетке происходит спонтанно как чисто физико-химическая реакция агрегации, требующая участия дополнительных факторов (рН, ионной силы, ионов металлов, осмоса и т.п.).
В связи с разнообразием структуры вирусов животных разнообразны и способы формирования вирионов, однако можно сформулировать следующие общие принципы сборки:
1) у просто устроенных вирусов формируются провирионы, которые затем в результате модификаций белков превращаются в вирионы. У сложно устроенных вирусов сборка осуществляется многоступенчато — сначала формируются нуклеокапсиды или сердцевины, с которыми взаимодействуют белки наружных оболочек;
2) сборка сложно устроенных вирусов (за исключением сборки вирусов оспы и реовирусов) осуществляется на клеточных мембранах. Сборка ядерных вирусов происходит с участием ядерных мембран, сборка цитоплазматических вирусов — с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда независимо друг от друга прибывают все компоненты вирусной частицы; 3) у ряда сложно устроенных вирусов существуют специальные гидрофобные белки, выполняющие функции посредников между сформированными нуклеокапсидами и вирусными гликопротеидами. Такими белками являются матриксные белки у ряда минус-нитевых вирусов (ортомиксо-, парамиксо-, рабдовирусов);
4) сборка нуклеокапсидов, сердцевин, провирионов и вири-онов происходит не во внутриклеточной жидкости, а в специальных структурах, предсуществующих в клетке или индуцированных вирусом («фабриках»);
5) сложно устроенные вирусы для построения своих частиц используют ряд элементов клетки-хозяина, например липиды, некоторые ферменты, у ДНК-геномного SV40 — гистоны, у оболочечных РНК-геномных вирусов — актин, а в составе аренавирусов обнаружены даже рибосомы. Клеточные молекулы несут определенные функции в вирусной частице, однако включение их в вирион может явиться и следствием случайной контаминации, как, например, включение ряда ферментов клеточных оболочек или клеточных нуклеиновых кислот.
В сборке ДНК-содержащих вирусов есть некоторые отличия от сборки РНК-содержащих вирусов. Как и у РНК-содержащих вирусов, сборка ДНК-содержащих вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. Первый этап сборки заключается в ассоциации ДНК с внутренними белками и формировании сердцевин или нуклеокапсидов. При этом ДНК соединяется с предварительно сформированными «пустыми» капсидами.
В результате связывания ДНК с капсидами появляется новый класс промежуточных форм, которые называются неполными формами. Помимо неполных форм с разным содержанием ДНК, существует другая промежуточная форма в морфогенезе – незрелые вирионы, отличающиеся от зрелых тем, что содержат ненарезанные предшественники полипептидов. Таким образом, морфогенез вирусов тесно связан с модификацией (процессингом) белков.
Сборка ядерных вирусов начинается в ядре, обычно – в ассоциации с ядерной мембраной. Формирующиеся в ядре промежуточные формы вируса (например, герпеса) почкуются в перинуклеарное пространство через внутреннюю ядерную мембрану, и вирус приобретает таким путем оболочку, которая является дериватом ядерной мембраны. Дальнейшая достройка и созревание вирионов происходят в мембранах эндоплазм этической сети и в аппарате Гольджи, откуда вирус в составе цитоплазматических везикул транспортируется на клеточную поверхность. У непочкующихся липидосодержащих вирусов (вирусов оспы) сборка вирионов происходит в уже описанных цитоплазматических «фабриках», Липидная оболочка вирусов в «фабриках» формируется из клеточных липидов путем автономной самосборки, поэтому липидный состав оболочек значительно отличается от состава липидов в клеточных мембранах
Выход вирусных частиц из клетки.
Существует два способа выхода вирусного потомства из клетки: путем взрыва и путем почкования. Выход из клетки путем взрыва связан с деструкцией клетки, нарушением ее целостности, в результате чего находящиеся внутри клетки зрелые вирусные частицы оказываются в окружающей среде. Такой способ выхода из клетки присущ вирусам, не содержащим липопротеидной оболочки (пикорна-, рео-, парво-, папова-, аденовирусы). Однако некоторые из этих вирусов могут транспортироваться на клеточную поверхность до гибели клетки.
Выход из клетки путем почкования присущ вирусам, содержащим липопротеидную мембрану, которая является дериватом клеточных мембран. При этом способе клетка может длительное время сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство, пока не произойдет полное истощение ее ресурсов.

12. Репродукция ДНК-геномных вирусов. Основные этапы, особенности репродукции. Примеры.

Репликация генома ДНК-содержащих вирусов в основном катализируется клеточными фрагментами, и механизм ее сходен с механизмом репликации клеточной ДНК. Синтез вирусных ДНК осуществляется с помощью ДНК-полимераз, источники которых могут быть различны. Репликация одноцепочных вирусных ДНК у парвовирусов (например, у латентного вируса крыс) синтезируются по принципу комплементарности с образованием промежуточной репликативной формы (ПРФ).
Стратегия вирусного генома в отношении синтеза и-РНК у разных вирусов различна. По механизму транскрипции ДНК-геномы вирусов можно разделить на 4 группы:
1. днДНК, транскрипцию которой осуществляют клеточные ферменты (ядерные полиома-, адено-, герпесвирусы, ряд бактериофагов, например фаг lambda; Т4).
Как правило, транскрипцию осуществляет РНК-полимераза II, реже — РНК-полимераза III (ряд транскриптов аденовируса). Возможны ситуации, когда транскрипцию ранних генов осуществляет клеточная РНК-полимераза, а поздних — вирусоспецифическая или модифицированная клеточная РНК-полимераза, содержащая вирусоспецифическую субъединицу (фаги Т7 и Т4, соответственно).
2.днДНК, раннюю транскрипцию которой осуществляют вирусные полимеразы, входящие в состав вириона. Поздние гены транскрибируются вновь синтезированными вирусными полимеразами, детерминированными геномом вируса (поксвирусы, фаг N4).
3.онДНК, которая прежде чем транскрибироваться должна перейти в двухнитевую форму (парвовирусы, включая дефектные вирусы, требующие для размножения наличия вируса-помощника).
4.Кольцевая частично двухнитевая днДНК (вирус гепатита B, вирус мозаики цветной капусты). Прежде чем транскрибироваться, ДНК проходит стадию репарации.
У некоторых вирусов, в основном ДНК-содержащих, существует три периода транскрипции: сверхранний, ранний и поздний. К ним относятся вирусы оспы, герпеса, папова-, адено-и иридовирусы. В результате сверхранней и ранней транскрипции избирательно считываются сверхранние и ранние гены с образованием сверхранних или ранних и-РНК. При поздней транскрипции считывается другая часть вирусного генома – поздние гены, с образованием поздних и-РНК. Многие сверхранние гены являются генами для неструктурных белков-ферментов и регуляторов транскрипции и репликации вирусного генома. Напротив, поздние гены обычно являются генами для структурных белков. Обычно при поздней транскрипции считывается весь геном, но с преобладанием транскрипции поздних генов. Фактором регуляции транскрипции у ядерных вирусов, является транспорт транскриптов из ядра в цитоплазму, к месту функционирования иРНК-полисомам.

13. Репродукция вирусов с РНК-вирусов: основные этапы и особенности репродукции вирусов с РНК-позитивной полярностью генома. Примеры.

Геномная (+)РНК — это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (некоторые вирусы растений).
Транскрипция (+)РНК-геномов может протекать двумя путями:
а)с образованием субгеномных мРНК (необходимы для синтеза ранних белков);
б)без образования субгеномных мРНК. В этом случае транскрипция будет являться также и репликацией.
Субгеномные (+)РНК, так же, как и геномные, считываются с полноразмерной минус-нити. Это может происходить двумя способами.
В одном случае образуются субгеномные РНК (один или несколько видов), которые имеют 3′-концы, идентичные 3′-концу полноразмерной плюс-нити, но имеют разные 5′-последовательности. Это связано с тем, что минус-нити РНК имеют участки, подобные промоторам. РНК-полимераза узнает эти участки, связывается с ними и может начинать синтез РНК с них, а не только с 3′-конца. Таким способом образуются субгеномные РНК у альфавирусов и ряда вирусов растений, в том числе у ВТМ.
Другой вариант образования субгеномных РНК реализуется у коронавирусов. В зараженной клетке обнаруживаются 6 классов субгеномных РНК. Нуклеотидные последовательности этих РНК идентичны (+)РНК не только по 3′-, но и по 5′-концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3′-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

14. Репродукция вирусов с РНК-вирусов: основные этапы и особенности репродукции вирусов с РНК-негативной полярностью генома. Примеры.

Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации. Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все вирусы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть непрерывны, а могут быть сегментированы.
Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного (-)РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, установленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах между участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специальные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи (+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3′- к 5′-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой кислоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5′-концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспецифических ферментов.
Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных (-)РНК геномов. Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегментами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Вирусоспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5′-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит одноцепочечный разрыв на расстоянии 10-13 нуклеотидов от его 5′-конца. Возникающий при этом короткий кэпированный клеточный олигонуклеотид и является затравкой для синтеза вирусоспецифических мРНК. Поли-А последовательность на 3′-конце образуется за счет пробуксовывания полимеразы так же, как и у вируса везикулярного стоматита. Однако на этом особенности транскрипции генов вируса гриппа не заканчиваются. Два геномных сегмента вируса гриппа являются матрицей для синтеза четырех молекул мРНК, так как имеют альтернативные открытые рамки считывания, подобно ДНК-геномам. Два дополнительных вида мРНК образуются путем сплайсинга, осуществляемого клеточными ферментами по обычному механизму.

15. Особенности транскрипции вирусов с разными геномами. Примеры.
Принципы транскрипции ДНК-геномов
По механизму транскрипции ДНК-геномы вирусов можно разделить на 4 группы:
1. днДНК, транскрипцию которой осуществляют клеточные ферменты (ядерные полиома-, адено-, герпесвирусы, ряд бактериофагов, например, фаг Т4).
Как правило, транскрипцию осуществляет РНК-полимераза II, реже — РНК-полимераза III (ряд транскриптов аденовируса). Возможны ситуации, когда транскрипцию ранних генов осуществляет клеточная РНК-полимераза, а поздних — вирусоспецифическая или модифицированная клеточная РНК-полимераза, содержащая вирусоспецифическую субъединицу (фаги Т7 и Т4, соответственно).
2.днДНК, раннюю транскрипцию которой осуществляют вирусные полимеразы, входящие в состав вириона. Поздние гены транскрибируются вновь синтезированными вирусными полимеразами, детерминированными геномом вируса (поксвирусы, фаг N4).
3.онДНК, которая прежде чем транскрибироваться должна перейти в двухнитевую форму (парвовирусы, включая дефектные вирусы, требующие для размножения наличия вируса-помощника).

4.Кольцевая частично двухнитевая днДНК (вирус гепатита B, вирус мозаики цветной капусты). Прежде чем транскрибироваться, ДНК проходит стадию репарации.
Принципы транскрипции РНК-геномов
1. (+)РНК-геномы
Геномная (+)РНК — это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (некоторые вирусы растений).
Транскрипция (+)РНК-геномов может протекать двумя путями:
а)с образованием субгеномных мРНК (необходимы для синтеза ранних белков);
б)без образования субгеномных мРНК. В этом случае транскрипция будет являться также и репликацией.
Субгеномные (+)РНК, так же, как и геномные, считываются с полноразмерной минус-нити. Это может происходить двумя способами.
В одном случае образуются субгеномные РНК (один или несколько видов), которые имеют 3′-концы, идентичные 3′-концу полноразмерной плюс-нити, но имеют разные 5′-последовательности. Это связано с тем, что минус-нити РНК имеют участки, подобные промоторам. РНК-полимераза узнает эти участки, связывается с ними и может начинать синтез РНК с них, а не только с 3′-конца. Таким способом образуются субгеномные РНК у альфавирусов и ряда вирусов растений, в том числе у ВТМ.
Другой вариант образования субгеномных РНК реализуется у коронавирусов. В зараженной клетке обнаруживаются 6 классов субгеномных РНК. Нуклеотидные последовательности этих РНК идентичны (+)РНК не только по 3′-, но и по 5′-концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3′-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.
2. (-)РНК-геномы
Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации. Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все вирусы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть непрерывны, а могут быть сегментированы.
Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного (-)РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, установленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах между участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специальные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи (+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3′- к 5′-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой кислоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5′-концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспецифических ферментов.
Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных (-)РНК геномов. Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегментами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Вирусоспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5′-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит одноцепочечный разрыв на расстоянии 10-13 нуклеотидов от его 5′-конца. Возникающий при этом короткий кэпированный клеточный олигонуклеотид и является затравкой для синтеза вирусоспецифических мРНК. Поли-А последовательность на 3′-конце образуется за счет пробуксовывания полимеразы так же, как и у вируса везикулярного стоматита. Однако на этом особенности транскрипции генов вируса гриппа не заканчиваются. Два геномных сегмента вируса гриппа являются матрицей для синтеза четырех молекул мРНК, так как имеют альтернативные открытые рамки считывания, подобно ДНК-геномам. Два дополнительных вида мРНК образуются путем сплайсинга, осуществляемого клеточными ферментами по обычному механизму.
3.Диплоидный (+)РНК-геном ретровирусов
Прежде чем произойдет транскрипция ретровирусного генома, он претерпевает целый ряд молекулярных превращений, включающих обратную транскрипцию, интеграцию ДНК в геном хозяина и только после этого — синтез мРНК с использованием клеточного транскрипционного комплекса. Геном ретровирусов монолитен, кодирует полипротеин, то есть транскрибируется без образования субгеномных РНК. Первичные транскрипты подвергаются сплайсингу.
4.днРНК-геном реовирусов
Транскрипцию осуществляет вирионная транскриптаза — РНК-зависимая РНК-полимераза, находящаяся в составе однокапсидной вирусной частицы.
У сложно устроенных РНК-содержащих вирусов транскрипция происходит не на голой матрице, а в составе транскрипционных комплексов. Капсидные белки обеспечивают правильную конформацию РНК, защиту от клеточных нуклеаз, связь фрагментов генома друг с другом, а также регуляцию транскрипции.
5.Амбисенс (обоюдозначащая, амбиполярная) РНК
Амбиполярная РНК имеет 5′-конец позитивной полярности, а 3′-конец негативной полярности. При попадании в клетку с геномной РНК считываются два класса комплементарных РНК: с 3′-конца считывается субгеномная мРНК и полноразмерный антигеном. Антигеном, в свою очередь, опять служит матрицей для двух классов РНК. С антигенома считывается вторая субгеномная мРНК и полноразмерная обоюдозначащая геномная, которая идет на построение вирусных частиц.

16. Трансляция вирусных белков. Инициация, элонгация, терминация. Посттрансляционная модификация

Синтез белка в клетке происходит в результате трансляции и-РНК. Трансляцией называется процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот. Процесс трансляции состоит из трех фаз: 1) инициации – стадия формирования комплекса компонентов, необходимого для узнавания места и начала процесса; 2) элонгации – стадия продолжения процесса, состоящего из повторяющихся действий; 3) терминации – стадия окончания процесса под действием специфических механизмов.
Инициация трансляции — это наиболее ответственный этап в процессе трансляции, основанный на узнавании рибосомой и-РНК и связывании с ее особыми участками. Вначале с и-РНК связывается малая рибосомальная субъединица. К комплексу и-РНК с малой рибосомальной субъединицей присоединяются другие компоненты, необходимые для начала трансляции. Это несколько молекул белка, которые называются «инициаторные факторы»
Элонгация трансляции — это процесс удлинения, наращивания полипептидной цепи, основанный на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. Происходит постоянное протягивание нити и-РНК через рибосому и «декодирование» заложенной в ней генетической информации.
Терминация трансляции происходит в тот момент, когда рибосома доходит до терминирующего кодона в составе иРНК.
Синтезированные вирусные белки подвергаются различным посттрансляционным модификациям:
1.Гликозилирование. Является процессом созревания вирусных поверхностных гликопротеинов и осуществляется клеточными гликозилазами на мембранах ЭПР и аппарата Гольджи. Как правило, белки гликозилируются олигосахаридами маннозного типа, но в ряде случае процесс может идти дальше и эти углеводные цепи замещаются на другие.
2.Ацилирование NH2-конца полипептидных цепей. Широко распространено у вирусов растений. У вирусов человека и животных 1-2 остатка жирных кислот (как правило, это миристиновая кислота) присутствуют в составе белка G вируса везикулярного стоматита, гемагглютинина вируса гриппа (НА), VP2 ротавируса и в белках некоторых других вирусов.
3.Фосфорилирование. Осуществляется ферментом протеинкиназой, который может быть вирусоспецифическим или клеточным. Протеинкиназа обнаружена в составе вирионов целого ряда вирусов — вируса оспы, вируса везикулярного стоматита, герпеса, ретровирусов и др. Протеинкиназы вирусного происхождения осуществляют как самофосфорилирование, так и фосфорилирование клеточных белков, что является важным фактором в регуляции экспрессии клеточных и вирусных генов.
4.Протеолитическая модификация. Представляет собой нарезание вирусных полипротеинов и фрагментацию поверхностных белков слияния, что приводит к их активации.
Нарезание полипротеинов-предшественников обеспечивают как вирусные, так и клеточные протеазы.
В зависимости от строения активного центра протеазы разделены на 4 класса — сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и цинксодержащие. Протеолиз полипротеина у тогавирусов и флавивирусов обеспечивают вирусоспецифические сериновые протеазы, у пикорнавирусов — цистеиновая, у ретровирусов — вирусная аспарагиновая и клеточная сериновая протеиназы. Протеолиз может протекать в ходе трансляции, то есть до завершения синтеза полипротеина (флавивирусы), или после завершения трансляции. Так, у пикорнавирусов протеолиз идет по каскадному механизму: сначала образуются крупные фрагменты полипептидной цепи, а затем они нарезаются на более мелкие полипептиды.

17. Патогенез вирусной болезни. Способы проникновения, диссиминации и выведения вирусов из организма хозяина.

Патогенез – совокупность процессов, вызывающих заболевание и определяющих его развитие и исход. Патогенез вирусного заболевания определяется следующими факторами: 1) тропизмом вируса; 2) скоростью репродукции вируса и количеством инфекционных частиц в потомстве; 3) реакцией клетки на инфекцию; 4) реакцией организма на вызванные инфекцией изменения клеток и тканей.
Тропизм вируса к определенным клеткам и органам характерен для большинства вирусных инфекций. В зависимости от поражения тех или иных органов и тканей различают нейроинфекции, инфекции дыхательных путей, кишечные и др. В основе тропизма вирусов лежит чувствительность к вирусу определенных клеток, а, следовательно, тканей и органов. Это свойство вирусов заражать лишь определенные клетки называется зависимым от хозяина ограничением. Патогенность вируса является генетическим признаком, обусловленным соотношением (констелляцией) вирусных генов. Фенотипическим проявлением патогенности является вирулентность. Этот признак значительно варьирует в разных системах. Вирулентность вируса определяется многими факторами организма: конституция, возраст, питание, наличие стресса, естественный и приобретенный иммунитет, интерферон могут определить течение инфекции и ее исход.
Понятие «токсичность» при вирусных инфекциях лишено смысла, так как ни эндотоксинов, ни экзотоксинов применительно к вирусам не существует.
В патогенезе выделяют несколько стадий, из которых 3 – основные: проникновение, диссеминация, выделение.
Вирус проникает в организм разными путями, которые определяются локализацией чувствительных клеток в организме и механизмом передачи вирусов от одного хозяина к другому.
Воздушно-капельный. Вирус проникает в дыхательные пути в составе капель, попавших в воздух из дыхательных путей больного. Вирусные частицы могут попадать также с частицами пыли. Крупные частицы пыли оседают на слизистой оболочке носа, а мелкие (не более 2 мкм) могут проникнуть глубоко в дыхательные пути и достичь альвеол.
Воздушно-капельным путем в организм попадают две группы вирусов: 1) респираторные вирусы, которые репродуцируются в эпителии слизистых оболочек дыхательных путей, вызывают местную (реже генерализованную) инфекцию и затем выводятся из организма; 2) вирусы, для которых дыхательные пути являются только входными воротами инфекции. Не вызывая местных поражений ткани, эти вирусы обусловливают генерализованную инфекцию, часто со вторичным поражением дыхательных путей. К таким вирусам относятся вирусы натуральной и ветряной оспы, кори, свинки.
Пищевой. Этим путем в пищеварительный тракт попадают энтеровирусы, реовирусы, многие альфа-вирусы, аденовирусы, некоторые парвовирусы и др.
Трансмиссивный. Вирус проникает в организм при укусе кровососущего насекомого (возбудители трансмиссивных инфекций – арбовирусы и некоторые вирусы семейства рабдовирусов).
Через кожу. Некоторые вирусы проникают в организм через поврежденную или даже неповрежденную кожу, например, вирусы бешенства (при укусе животных), коровьей оспы, папилломы.
Половой. Таким путем в организм проникают вирусы герпеса, бородавок человека (семейство паповавирусов).
Парентеральный (через кровь). Этим путем в организм попадает вирус гепатита В. Заражение вирусом может произойти при всякого рода парентеральных манипуляциях — хирургических вмешательствах, переливании крови, стоматологических операциях, при маникюре и педикюре и т. д.
Вертикальный. Этот путь передачи встречается, в частности, при интеграционных инфекциях, когда в дочерние клетки попадает клеточный геном с интегрированными последовательностями вирусного генома, и при инфекциях с внутриутробным заражением плода, что характерно для вируса краснухи при заболевании женщин, особенно в первые 3 мес беременности. Поражения плода могут вызывать вирусы цитомегалии, простого герпеса, Коксаки и др.
Диссеминация (распространение по организму) может проходить по следующим путям:
с кровью (вирусемия):
— первичная вирусемия (для вирусов проникающих трансмиссивным путем),
— вторичная вирусемия после накопления в первичном очаге (для вирусов проникающих другими путями)
Гематогенный путь является основным путем распространения вируса в организме, и вирусемия является обычным симптомом при большинстве вирусных инфекций. В кровь вирусы могут поступать из лимфатической системы, переноситься с помощью лейкоцитов, проникать в кровеносные капилляры из первично инфицированных тканей. Вирусемия поддерживается путем постоянного поступления вирусов в кровь или же при нарушении механизмов элиминации вирусов из крови.
с лимфой
Лимфатические сосуды являются одним из основных путей, по которым вирус распространяется от места первоначальной локализации (кожа, слизистая оболочка дыхательных путей и пищеварительный аппарат). Примером распространения вирусов по лимфатической системе является поражение лимфатических узлов после подкожной противооспенной вакцинации, при кори и краснухе, инфицирование миндалин и аденоидной ткани при аденовирусной инфекции. Инфицированные лимфатические узлы могут быть вторичным очагом инфекции.
3. по нервам (для нейротропных вирусов: в. бешенства, болезни Борна, алеутской болезни норок, герпесвирусов).
Нейрогенный путь распространения вирусов вдоль периферических нервов присущ вирусам бешенства, простого герпеса, полиомиелита. Вирус бешенства распространяется от входных ворот инфекции — места укуса — по нервам центростремительно к ЦНС, а оттуда — в слюнные железы, из которых вирус выделяется в слюну.
Скорость распространения вирусов в организме и достижения чувствительных тканей определяет длительность инкубационного периода. Короткий инкубационный период имеют очаговые инфекции (грипп и другие респираторные инфекции, вирусные гастроэнтериты и др.), длительный — инфекции, возбудители которых попадают в чувствительные ткани после генерализации процесса (вирусные гепатиты).
Последняя стадия патогенеза – выделение вируса из организма: дермотропные вирусы выделяются с пораженными клетками кожи (в.оспы, ящура), с молоком (в.ящура); пневмотропные вирусы (в. гриппа) — через носоглотку со слизью; пантропные вирусы (в. гриппа птиц, вирус болезни Ньюкасла и др.) — через разные выделительные системы: носоглотку, кишечник, кожу, молочные железы и т.д. с разными секретами и экскретами — слизью, мочой, фекалиями, слюной, молоком, молозивом и т.д.

18. Этапы патогенеза вирусной болезни. Практическое значение патогенеза болезни при ее диагностике.
Стадии патогенеза:
I ст. — проникновение вируса в организм
II ст. — первичная локализация и репродукция вируса
III ст. — первичная диссеминация вируса
IV ст. — вторичная локализация и репродукция вируса
V ст. — вторичная диссеминация вируса
VI ст. — выделение вируса из организма

Іст. Вирус проникает в организм разными путями, которые определяются локализацией чувствительных клеток в организме и механизмом передачи вирусов от одного хозяина к другому.
Пути передачи: воздушно-капельный; пищевой; трансмиссивный (укусы насекомых), через кожу, половой, парентеральный (через кровь), вертикальный (от матери к ребенку).
II ст. может проходить по следующим путям:
Первичная локализация и репродукция вируса в месте проникновения (входные ворота). Такой путь проходят в основном вирусы, проникающие в организм:
— аэрогенным путем: аденовирус, в. оспы, в. гриппа, в. болезни Ньюкасла,
— некоторые вирусы, проникающие контактным путем: в. бешенства
2. Первичная локализация и репродукция вируса вдали от входных ворот. Такой путь проходят в основном вирусы, проникающие в организм:
— алиментарным путем: в. трансмиссивного гастроэнтерита свиней, в.
ящура, в. болезни Тешена, в. диареи и др.,
— некоторые вирусы, проникающие аэрогенным путем: в. болезни Ауэски, в. классической и в. африканской чумы свиней и т.д.,
ІІІ ст Первичная вирусемия (диссеминация). Такой путь проходят в основном вирусы, проникающие в организм трансмиссивным путем: в. инф.анемии, в. чумы свиней, в. клещевого энцефалита, т.д
Диссеминация ) может проходить по следующим путям:
с кровью (вирусемия):
— первичная вирусемия (для вирусов проникающих трансмиссивным путем),
— вторичная вирусемия после накопления в первичном очаге (для вирусов проникающих другими путями)
Гематогенный путь является основным путем распространения вируса в организме, и вирусемия является обычным симптомом при большинстве вирусных инфекций. В кровь вирусы могут поступать из лимфатической системы, переноситься с помощью лейкоцитов, проникать в кровеносные капилляры из первично инфицированных тканей. Вирусемия поддерживается путем постоянного поступления вирусов в кровь или же при нарушении механизмов элиминации вирусов из крови.
с лимфой
Лимфатические сосуды являются одним из основных путей, по которым вирус распространяется от места первоначальной локализации (кожа, слизистая оболочка дыхательных путей и пищеварительный аппарат). Примером распространения вирусов по лимфатической системе является поражение лимфатических узлов после подкожной противооспенной вакцинации, при кори и краснухе, инфицирование миндалин и аденоидной ткани при аденовирусной инфекции. Инфицированные лимфатические узлы могут быть вторичным очагом инфекции.
3. по нервам (для нейротропных вирусов: в. бешенства, болезни Борна, алеутской болезни норок, герпесвирусов).
Нейрогенный путь распространения вирусов вдоль периферических нервов присущ вирусам бешенства, простого герпеса, полиомиелита. Вирус бешенства распространяется от входных ворот инфекции — места укуса — по нервам центростремительно к ЦНС, а оттуда — в слюнные железы, из которых вирус выделяется в слюну.
IVст. (вторичная локализация и репродукция вируса) можно рассматривать по следующим направлениям:
1. Внутриклеточный цикл репродукции вируса (патогенез на уровне клетки): — Продуктивная инфекция — это инфекция, при которой репродукция заканчивается образованием зрелых вирионов, обладающих инфекционностью.
— Абортивная инфекция (незавершенная) — это инфекция, при которой репродукция вируса в клетке не завершается образованием зрелых вирионов или они образуются лишь в незначительном количестве (полиома-, парва-, герпес-, парамиксо-, рабдовирусы). Причины абортивной инфекции : инфекция дефектным вирусом ( дефект по какому-то гену); инфекция генетически резистентных клеток; инфекция проходит в неразрешающих условиях (повышенная Т, определенная рН и т.д.).
2. Патоморфологические и функциональные изменения клетки при репродукции вируса:
— цитопатический эффект (ЦПЭ), цитопатическое действие (ЦПД) – это повреждения клеток при вирусной инфекции, приводящее к их морфологическому разрушению и функциональной патологии. ЦПД проявляется в изменении проницаемости мембран; вакуолизации цитоплазмы; образовании внутриклеточных включений; образовании многоядерных клеток; хроматинных абберациях.
3. Исход вирусной инфекции на уровне клетки: лизис клетки, интеграция НК вируса в клеточный геном, трансформация клетки.
VI ст. — выделение вируса из организма: дермотропные вирусы выделяются с пораженными клетками кожи (в.оспы, ящура), с молоком (в.ящура); пневмотропные вирусы (в. гриппа) — через носоглотку со слизью; пантропные вирусы (в. гриппа птиц, вирус болезни Ньюкасла и др.) — через разные выделительные системы: носоглотку, кишечник, кожу, молочные железы и т.д. с разными секретами и экскретами — слизью, мочой, фекалиями, слюной, молоком, молозивом и т.д.
Знание патогенетических особенностей той или иной вирусной инфекции имеет большое значение в клинической практике. По особенностям течения, клиническим симптомам, пути передачи можно быстро установить предварительный диагноз, выбрать и назначить метод лечения еще до идентификации возбудителя лабораторными методами, которые требуют значительных временных затрат.

19. Нейропробазия и септиневрит как формы диссеминации нейротропных вирусов на примере вируса бешенства

Нейропробазия – это передвижение вируса по афферентным нейронам (центростремительно), а септиневрит – передвижение по эфферентным (центробежно). Разница между двумя видами заключается в напралении движения нервного импульса: афферентная иннервация проводит неврный импульс от органов в ЦНС по центростремительным волокнам, получая его от рецепторов внутренних органов, а эфферентная иннервация – это, собственно, ответная реакция ЦНС на полученный сигнал, который поступает по центробежным нейронам.
После внедрения через поврежденную кожу вирус бешенства распространяется по нервным стволам. В HYPERLINK «http://medbiol.ru/medbiol/physiology/000f8197.htm» нервную систему он попадает через HYPERLINK «http://medbiol.ru/medbiol/physiology/001bad23.htm» нервно-мышечные синапсы и HYPERLINK «http://medbiol.ru/medbiol/ssb/00135921.htm» сухожильные рецепторы Гольджи — в обеих структурах имеются уязвимые для вируса безмиелиновые нервные окончания. Далее вирус медленно, со скоростью около 3 мм/ч, продвигается по нервным волокнам в ЦНС, по-видимому с аксоплазматическим током. Достигнув HYPERLINK «http://medbiol.ru/medbiol/physiology/001bae86.htm» ЦНС, вирус приступает к размножению, которое идет почти исключительно в сером веществе, после чего распространяется в обратном направлении,поражая практически всю нервную систему, по HYPERLINK «http://medbiol.ru/medbiol/mozg/0002d8f4.htm» вегетативным нервным волокнам — в слюнные железы, мозговое вещество надпочечников, почки, легкие, печень, скелетные мышцы, кожу и сердце. Репродукция вируса в слизистых секреторных клетках слюнных желез обеспечивает дальнейшую передачу инфекции со слюной.
Размножаясь в нервной ткани (головной и спинной мозг, симпатические ганглии, нервные узлы надпочечников и слюнных желез), вирус вызывает в ней характерные изменения (отек, кровоизлияния, дегенеративные и некротические изменения нервных клеток). Разрушение нейронов наблюдается в коре большого мозга и мозжечка, в зрительном бугре, подбугорной области, в черном веществе, ядрах черепных нервов, в среднем мозге, базальных ганглиях и в мосту мозга. Однако максимальные изменения имеются в продолговатом мозге, особенно в области дна IV желудочка. Вокруг участков пораженных клеток появляются лимфоцитарные инфильтраты (рабические узелки). В цитоплазме клеток пораженного мозга (чаще в нейронах аммонова рога) образуются оксифильные включения (тельца Бабеша-Негри), представляющие собой места продукции и накопления вирионов бешенства.

20. Взаимосвязь этапов патогенеза вирусной болезни и иммунного ответа

Ранний защитный воспалительный ответ призван препятствовать внедрению и распространению возбудителя, по возможности быстро удалять его из организма. Он разыгрывается в течение первых 4 суток после внедрения возбудителя и обеспечивается факторами врожденного иммунитета, к которым относятся фагоцитирующие клетки крови, белковые молекулы, обладающие защитными свойствами (компоненты системы комплимента), а также межклеточные медиаторы – цитокины. Ранний воспалительный ответ, предшествуя последующему специфическому иммунному ответу, влияет на его форму, способствует развитию наиболее эффективного против конкретного микроорганизма специфического иммунного ответа. Ранний воспалительный ответ начинается с превлечения лейкоцитов из кровяного русла в очаг инфекции с последующей их активацией для удаления возбудителя. Мобилизация лейкоцитов в очаг инфекции стимулируется провоспалительными цитокинами, а опосредуется адгезивными молекулами на поверхности лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Кроме того, активированные цитокинами эндотелиальные клетки продуцируют хемокины, достигающие высокой концентрации на уровне очага инфекции. Этим обеспечивается прочная адгезия лейкоцитов к эндотелиальным клеткам с последующей их миграцией и выходом в ткани в направлении очага инфекции. Активированные под влиянием провоспалительных цитокинов, эндотелиальные клетки продуцируют молекулы вазомедиаторов, под действием которых усиливается местный кровоток, повышается проницаемость сосудов для макромолекул фибриногена, который, покидая сосуды, превращается в фибрин, что способствует ограничению очага инфекции.
В случае неэффективности раннего защитного ответа и факторов врожденного иммунитета в организме накапливается большое количество вирусных частиц, которые для нашего организма являются чужеродными антигенами. Контакт этих антигенов с клетками иммунной системы приводит к развитию специфического иммунного ответа, который начинается с этапа представления и распознавания антигена. Затем начинает формироваться гуморальный иммунный ответ, т.е. синтезироваться специфические антитела. Их синтез направлен на нейтрализацию возбудителя, т. е. утрату им способности оказывать токсическое действие на организм. К концу 1-й недели заболевания в сыворотке крови накапливаются IgM, которые к 10-14-му дню заменяются являющимися наиболее значимыми, долговременными и активными антителами – IgG. Секреция ІgА может иметь место во входных воротах инфекции. Эти секреторные антитела, избирательно адсорбируясь на эпителиальных клетках респираторного и кишечного трактов, играют существенную роль в противовирусном иммунитете, поскольку они препятствуют проникновению вирусов — возбудителей респираторных и кишечных заболеваний, в чувствительные к ним клетки.

21. Факторы противовирусного иммунитета. Их характеристика и роль.

Организм человека и животных обладает неспецифической и специфической защитой от вирусов, которая включает как гуморальные, так и клеточные факторы иммунитета.
Основные механизмы неспецифической и специфической защиты организма от вирусных инфекций направлены на ограничение и по давление вирусной репродукции в чувствительных к ним клетках, а не на разрушение возбудителя, как это имеет место при антибактериальном иммунитете и других его видах.
Нарушение вирусом постоянства внутренней среды организма мобилизует прежде всего врожденные неспецифические факторы противовирусной защиты наряду с непрерывно возрастающей активностью специфического иммунитета.
Неспецифические факторы:
Температура тела является одним из важных факторов регуляции репродукции вируса в чувствительных к нему клетках. Повышение температуры способствует задержке и подавлению репродукции вирионов, но в то же время стимулирует продукцию интерферона и специфический иммунный ответ.
Явление интерференции. Это способность одного вируса подавлять репродукцию другого вируса в клетке-хозяине. В механизме интерференции основную роль играет образование клетками интерферона — мощного ингибитора репродукции вирусов.
Интерферон – белок с молекулярной массой около 30 ООО. Он содержится в незначительном количестве в здоровом организме. Под влиянием вирусов количество интерферона резко увеличивается в различных клетках организма человека и животных. Наибольшая продукция интерферона обеспечивается лимфоцитами. Интерферон не является специфическим агентом, поскольку блокирует репродукцию разнообразных вирусов. Вместе с тем он обладает тканевой специфичностью, так как клетки разных тканей образуют неодинаковый интерферон. Механизм противовирусного действия интерферона заключается в нарушении трансляции вирусной иРНК рибосомами клетки хозяина и прекращении синтеза белка. Существует предположение, что репродукция вируса подавляется не самим интерфероном, а индуцируемым им клеточным белком. Интерферон препятствует также распространению вируса на соседние клетки, ограничивая тем самым вирусную инфекцию.
Клеточная ареактивность. Клеточная, или органо-тканевая, ареактивность к вирусам связана с отсутствием у них рецепторов и ферментов раздевания (депротеинизации). Ослабить врожденную ареактивность тканей как наследственно обусловленный признак не удается даже сильными дозами рентгеновского облучения. Достичь этого возможно лишь путем скрещивания высокоустойчивых и чувствительных линий животных.
Нормальные (естественные) киллеры. NK-клетки, или нормальные киллеры (убийцы), — специализированные большие лимфоциты диаметром 12-15 мкм, содержащие в обильной цитоплазме многочисленные гранулы с цитотоксическими веществами (рис. 20). Основным их отличием является то, что на внешней мембране они не имеют присущих В- и Т-клеткам маркеров (молекул) и антигенраспознающих рецепторов. Кроме этого, на NK-клетках определяются адгезивные молекулы и С-лектин — белок- рецептор, распознающий углеводные остатки на клетках- мишенях, которыми служат разного рода трансформированные и быстро пролиферирующие клетки. Их цитолиз осуществляется на основе взаимодействия с углеводными детерминантами делящихся клеток (лектиновое распознавание) с последующим выделением из гранул NK-клеток белков-перфоринов и гранзимов (сериновых протеиназ), которые, проникая через перфориновые поры в клетки-мишени, запускают программированную гибель клеток (апоптоз) с сегментацией ДНК и отделением хроматиновых фрагментов, окруженных оболочкой.
Вирусные Р-ингибиторы – сывороточные термолабильные вируснейтрализующие вещества. По химическому составу они являются Р-липополипротеидами. Реагируя с вирусами, Р-ингибиторы вначале образуют нейтральный комплекс, из которого вирус довольно легко реактивируется. Необратимая инактивация вируса наступает только после 2-часового контакта и во многом зависит от присутствия кофактора – особого макроглобулина, усиливающего повреждающее действие Р-ингибиторов.
К специфическим факторам противовирусного иммунитета относятся антитела, в образовании которых, как было отмечено, решающую роль играют Т- и В-лимфоциты и их кооперация с макрофагами. При вирусных инфекциях, так же как и при заболеваниях, вызванных другими микроорганизмами, продуцируются антитела, представленные иммуноглобулинами разных классов. К концу 1-й недели в сыворотке крови накапливаются IgM, которые к 10-14-му дню заменяются являющимися наиболее значимыми, долговременными и активными антителами – IgG. Секреция ІgА может иметь место во входных воротах инфекции. Эти секреторные антитела, избирательно адсорбируясь на эпителиальных клетках респираторного и кишечного трактов, играют существенную роль в противовирусном иммунитете, поскольку они препятствуют проникновению вирусов — возбудителей респираторных и кишечных заболеваний, в чувствительные к ним клетки.
Вируснейтрализующие антитела и антигемагглютинины, содержащиеся в кровяном русле, подавляют инфекционные свойства вируса. Противовирусные антитела, циркулирующие в крови, взаимодействуют только с внеклеточным вирусом и не влияют на репродукцию вируса в клетке. Вместе с тем способность, некоторых вирусов изменять иммунохимическую специфичность своих поверхностных белков препятствует их нейтрализации антителами. Такой механизм самозащиты характерен главным образом для вируса гриппа.
Возбудители хронических вирусных инфекций, которые длительно персистируют в организме, постоянно вызывая вирусемию, репродуцируются в клетках иммунной системы организма — лимфоцитах и макрофагах. Это приводит к резкому подавлению неспецифических и специфических факторов защиты, а также к развитию иммунопатологических состояний.

22. Факторы неспецифического иммунитета при вирусных болезнях. Интерферон: природа, синтез в организме, противовирусное действие.

К одним из факторов неспицифического иммунитета относятся интерфероны. По структуре – это белки, по эффектам действия – универсальные вирусные ингибиторы и цитокины, вырабатывающиеся при вирусных инфекциях и регулирующие иммунные реакции при них.
Различают два типа интерферонов (ИНФ).
ИНФ I типа. Как антивирусный фактор ИНФ 1 типа был открыт в 1957 г. А. Айзексом и Дж. Линденманом. Имеются две серологические группы ИНФ I типа –α и β. α-ИНФ — это семейство 20 гликопротеидов с молекулярной массой около 18 кД. β-ИНФ — гликопротеид массой 20 кД. Отличаясь по структуре, они обладают одинаковым механизмом действия. α-ИНФ продуцируется лейкоцитами, главным образом мононуклеарными фагоцитами, а β-ИНФ — фибробластами, обработанными вирусами и их антигенами. В организме секретируются всеми клетками и в месте входных ворот вирусов концентрация интерферона в считанные часы многократно возрастает. При этом интерферонообразование определяется некоторыми системами активации комплемента, в частности усиливают продукцию ИНФ I типа пирогенное действие интерлейкина-1 и понижение рН в межклеточной жидкости на фоне повышения температуры.
Продолжительность интерферонообразования зависит от времени репродукции вируса в клетках. В отличие от антител ИНФ I типа обладает широким спектром антивирусного действия, подавляет размножение не только инфекционных, но и онкогенных интеграционных вирусов. Однако полиэтиологическая антивирусная активность интерферонов ограничена тем видом животного, клетки которого его выработали. Даже в организме родственных видов противовирусная эффективность ИНФ I типа почти полностью утрачивается. Исключение составляют ИНФ I типа человека, активный также в организме кролика.
Механизм антивирусного действия ИНФ I типа многообразный. В частности, под его воздействием в клетках индуцируется синтез двух ферментов – олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы. При этом первая катализирует 2,5-олигоадениловую кислоту, активирующую клеточные нуклеазы на разрушение вирусных иРНК, а вторая – фосфорилирует а-субъединицу инициирующего фактора трансляции и блокирует его, в результате чего вирионная иРНК утрачивает способность связываться с рибосомой. Антивирусный эффект интерферона посредством блокады трансляции проявится также и в том случае, когда он коснется клеточной иРНК, так как на фоне ингибирования пролиферации клеток репродукция вирусов замедляется или же прекращается. Кроме того, ИНФ I типа усиливает литическое действие нормальных киллеров на клетки-мишени, индуцирует экспрессию антигенов МНС класса I и тем самым способствует распознаванию инфицированных вирусами клеток с последующим их лизисом.
ИНФ II типа. Называется γ-интерфероном. Представляет собой чувствительный к кислой среде гликопротеин с молекулярной массой 20-25 кД. Источником γ-ИНФ служат активированные цитотоксические лимфоциты (активированные Т-киллеры) и NK-клетки. Пик его образования приходится на 48-72-й ч после начала действия вирусов. Продолжительность синтеза γ-ИНФ — около 2 недель. Продукция γ-интерферона индуцируется теми же веществами, которые способствуют выделению α- и β-интерферонов. Усиливается по мере нарастания секреции и под воздействием интерлейкина 2 (цитокина ИЛ-2), который активирует цитотоксические лимфоциты. Интерферон γ подавляет репликацию вирусов точно так же, как другие интерфероны. Важнейшей его функцией является участие в опосредовании взаимосвязей между лимфоцитами и макрофагами. Служит стимулятором макрофагов, способствует обработке и представлению ими антигенов, а также выработке цитокинов, в частности интерлейкина 12, который в свою очередь усиливает секрецию γ-ИНФ, подавляет проявление гуморального иммунного ответа и направляет его развитие в сторону клеточного. Являясь гуморальным продуктом Т- и NK-клеток, он, по-видимому, участвует в реализации их цитотоксического эффекта.

23. Факторы специфического иммунитета при вирусных болезнях. Роль клеточного иммунитета в защите организма от вируса.

Среди клеточных факторов приобретенного антивирусного иммунитета основную роль играют Т-киллеры, которых сейчас чаще называют цитотоксическими лимфоцитами. По структуре и функции они очень сходны с нормальными киллерами, но в отличие от NK-клеток способность к цитолизу приобретают только после активации, в основе которой лежит распознавание вирусного пептида в комплексе с молекулами МНС I класса на А-клетках. Как и НК, связавшись с клетками-мишенями, цитотоксические лимфоциты выделяют перфорины и гранзимы, разрушая их мембраны и фрагментируя ДНК. Но, кроме того, при Т-клеточном цитолизе в реакцию могут вовлекаться фактор некроза опухолей и лимфотоксин, активирующий нейтрофилы, макрофаги, а, главное, нормальные киллеры.
Деструктивные процессы, вызванные цитотоксическими лимфоцитами, в конечном итоге приводят к тому, что, оказавшись вне клеток и попав в межклеточную жидкость и кровоток, вирусы быстро обезвреживаются антителами и Р-ингибиторами. Защитный эффект цитолиза инфицированных вирусами клеток особенно ярко проявляется на ранних стадиях заболевания. Массивный цитолиз вирусных клеток-мишеней при далеко зашедшей генерализованной инфекции может приводить к серьезным повреждениям в органах и тканях, образованию веществ, индуцирующих продукцию аутоантител и активирующих агрессивные клоны Т-киллеров, способных вызывать аутоиммунные патологические процессы. Возникают они, однако, редко и чаще всего являются следствием подавления активности супрессоров.
Роль макрофагов в противовирусном иммунитете оценивается неоднозначно. Считается, что вирусы из-за очень малых размеров плохо фагоцитируются, проявляют большую устойчивость к лизосомальным ферментам, а некоторые из них, например вирусы медленных инфекций, кори и герпеса, даже размножаются в фагоцитах. В качестве самого серьезного довода против признания защитной роли фагоцитов в противовирусном иммунитете приводятся некоторые данные о том, что, мигрируя, макрофаги диссеминируют репродуцирующиеся в них вирусы на чувствительные клетки. Учитывая это, нельзя забывать, что микрофаги как антигенпрезентирующие клетки участвуют в выработке противовирусных антител, являются продуцентами интерферонов, активно поглощают зараженные вирусами клетки, медленно, но инактивируют многие вирусы. Наконец, способность макрофагов удерживать и переваривать вирусы постепенно нарастает и у взрослых животных выражена в большей степени, чем у новорожденных.

24. Вирусные белки, их роль в серодиагностике. Специфические антитела. Характеристика иммуноглобулинов

Вирусные капсидные белки являются очень важными диагностическими маркерами в лабораторной диагностике. Такое свойство вирусных капсидных белков (гаммаглютининов), которые способны вызывать склеивание эритроцитов, используют при постановке реакции прямой геммаглютинации. Реакция прямой гемагглютинации широко применяется в вирусологической практике как быстрый, технически простой, дешевый и достаточно надежный метод выявления вирусов в исследуемом материале и установления их гемагглютинирующих свойств.
Другое свойство вирусных капсидных белков – выступая в роли антигенов обладать способностью специфически связываться с антителами в организме человека и животных – используется в серодиагностике при проведении, например, непрямой реакции геммаглютинации, иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа. При проведении этих серологических реакций с биологическими жидкостями (чаще всего используется сыворотка крови) можно установить не просто наличие вируса в организме, но его идентифицировать и установить титр (количество), т. к. реакции проводятся с заранее «известными» антителами, которые являются строго специфичными к вирусу, который выявляют.
Вирусные иммуноглобулины. Как и при других инфекциях, антивирусный иммунитет обеспечивают 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgE, IgD — мономеры с двумя антисвязывающими центрами; IgM — пентамер, состоящий из пяти полимеризованных (связанных) мономеров, имеющих 10 антигенсвязывающих центров, и IgA, представленный в сыворотке крови мономером, а на слизистых оболочках димером с 4 антигенсвязываюшими центрами, которые принято называть IgAS, т. е. секреторным иммуноглобулином.
Защитный эффект разных классов иммуноглобулинов в отношении вирусов неодинаков. Так, сывороточные IgG, IgM и IgA обеспечивают невосприимчивость к вирусам, вызывающим генерализованные инфекции, a IgAS, выстилающие слизистые оболочки, — к вирусам, поражающим респираторные пути и кишечный тракт. IgE, фиксирующиеся на клетках, реагируя с вирусами, могут вызывать аллергические реакции или развитие аутоиммунных процессов. Низкий уровень вируснейтрализующих антител обусловливает тяжелое течение вирусной инфекции, переходом ее в хроническую форму и плохим прогнозом болезни. Наоборот, высокий уровень вируснейтрализующих антител в крови приводит к быстрому разрешению болезни и освобождению организма от вирусов.
Однако при некоторых вирусных инфекциях избыток сывороточных антител не всегда улучшает состояние больных. Нередко в иммунных комплексах вирусы не только не обезвреживаются, но даже находят благоприятные условия для длительного персистирования, так как антитела могут прикрывать их от деградирующего действия клеточных ферментов.
Кроме того, избыточное содержание свободноплавающих иммунных комплексов в кровотоке всегда ведет к их осаждению на клетках, что сопровождается функциональными и структурными нарушениями в органах и тканях, а нередко развитием аутоиммунных болезней. К выработке аутоантител может также приводить конформационная перестройка структуры антител в иммунных комплексах. Не эффективны вируснейтрализующие антитела при вирусных инфекциях, возбудители которых, внедрившись в организм, диссеминируют по межклеточным отросткам и контактирующим мембранам, не попадая в лимфу и кровь. Полностью защищены от антител интеграционные вирусы в состоянии провируса.
В лабораторной диагностике исследование наличия и уровня антител различных классов при той или иной вирусной инфекции в некоторых случаях помогает определить стадии инфекционного процесса. Как правило, в первичной фазе инфицирования в сыворотке крови выявляют высокие титры иммуноглобулинов класса М и А, а при хронизации процесса – G.

25. Противовирусные вакцины. Классификация. Способы получения. Их роль в борьбе с вирусными болезнями. Примеры.

Антивирусные вакцины представляют собой антигены, которые, как и все другие, активируя иммунокомпетентные клетки организма, вызывают образование иммуноглобулинов и развитие многих других защитных иммунологических процессов, обеспечивающих невосприимчивость к вирусным инфекциям. При этом создающийся ими искусственный антивирусный иммунитет, так же как и постинфекционный, возникает через 10-14 дней и в зависимости от качества вакцины и индивидуальных особенностей организма сохраняется от нескольких месяцев до нескольких лет. Массовые прививки позволяют создать коллективный активный иммунитет и обеспечить эпидемиологическое благополучие населения. Они регулируются государственными законами и проводятся по эпидемическим показаниям при угрозе вирусных эпидемий, большом риске заболевания при выезде в регионы с природной очаговостью по особо опасным вирусным инфекциям или осуществлении плановых декретированных прививок. В настоящее время существует несколько классификаций вакцин, но наиболее популярной является по происхождению антигена. Существует несколько классификаций вакцин:
По назначению:
Профилактические;
Лечебные;
По природе иммуногенов вакцины:
Бактериальные;
Вирусные;
Риккетсиозные;
Антитоксические;
По количеству компонентов:
Моновакцины;
Поливакцины;
По способу приготовления:
Вакцины 1 поколения;
Вакцины 2 поколения;
Вакцины 3 поколения;
Ассоциированные.
Наиболее распространенной является классификация вакцин по происхождению антигена:
І поколение — живые ослабленные (аттенуированные) и убитые (инактивированные) вакцины;
ІІ поколения — химические вакцины и анатоксины;
ІІІ поколения — рекомбинантные вакцины;
ІV поколения — синтетические (пептидные), антиидиотипические, ДНК-вакцины, мукозальные, липосомальные, вакцины на основе трансгенных растений и тому подобное.
Первое поколение вакцин – это корпускулярные вакцины (цельномикробные, цельновирионные). Они делятся на убитые и живые.
В настоящее время из живых (аттенуированных или ослабленных) вакцин известны: ротавирусная, коревая, полиомиелитная, вакцина желтой лихорадки и лихорадки Ку.
Преимущества живых вакцин:
По механизму действия похожи на дикие штаммы;
Формируют эффективный гуморальный и клеточный иммунитет;
Легко проводить вакцинацию, так как необходимы небольшие дозы и требуется только однократная вакцинация.
Недостатки:
Содержат до 99% балласта – реактогенны (много побочных действий);
Способны вызывать мутации клеток организма;
Трудно дозируются, требуют особых условий хранения;
Есть вероятность возвращения в вирулентную форму.
Убитые (инактивированные). Убитые вакцины изготовляют из микрооргнизмов, убитых физическим (нагревание) или химическим (фенол, формалин, ацетон) методами. Из вирусных убитых вакцин известны: гриппозная инактивирвоанная жидкая; вакцина против клещевого энцефалита; вакцина против клещевой энцефалита; антирабическая; вакцина против гепатита А и В.
Преимущества:
Стабильны и безопасны;
Легко дозируются.
Недостатки:
Реактогенны;
Содержат фенол;
Требуется ревакцинация.
В состав вакцины входят:
— действующий компонент, представляющие специфические антигены,
— консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении, 86
— стабилизатор, который продлевает срок годности вакцины,
— полимерный носитель, который повышает иммуногенность антигена (АГ).
Основные этапы производства:
Накопление вирусного материала
Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. Культивирование вирусов проводят в культуре клеток, в куриных эмбрионах или в организме лабораторных животных. После накопления вирусов в клетках, следующим этапом в производстве вакцин является индикация, идентификация и
определение титра вирусного материала.
Выделение, очистка вирусного материала от балластных веществ, концентрирование вирусного материала.
Добавление консервантов, стабилизантов.
Разлив в ампулы или флаконы. Лиофилизация.
Контроль качества на чистоту (отсутствие каких-либо контаминантов), на безвредность, на реактогенность (то есть иммунную и специфичную активность), на эпизоотическую безопасность и эффективность, на стабильность при хранении.
Производство вакцин, содержащих убитые вирусы, отличается от производства живых ослабленных вакцин лишь тем, что выделенные из культуральной среды возбудители инактивируют с помощью химических соединений, например формальдегида или бета-пропиолактона. Вирусы, выделяемые из надосадочной жидкости после разрушения выращенных в культуре клеток, практически не содержат клеточных компонентов. Кроме того, больший по сравнению с другими компонентами культуральных сред размер вирусных частиц обеспечивает возможность высокой степени очистки. Эти характеристики «убитых» вакцин обеспечивают их выбор при необходимости индукции гуморального (антителозависимого) иммунитета против вирусных заболеваний.
Ко второму поколению вакцин относят: химические вакцины (субклеточные или субъединичные) и анатоксины (в бактериологии).
Химические вакцины являются безкорпускулярними и представляют собой наборы химических веществ, которые выступают для определенного возбудителя как протективные антигены. Их получают из поверхностных и субвирионных антигенов вирусов вирусных структур с помощью разных методов экстракции и очистки: экстрагирования трихлоруксусной кислотой, обработки детергентами, осаждения антигенов спиртом, сернокислым аммонием, с использованием диализа, ультрафильтрации, афинной хроматографии и т.д.
Для повышения иммуногенности химические вакцины комбинируют с адъювантами, которыми является фосфат кальция, гидроокись алюминия, и другие. Большие перспективы связывают с созданием липосомных вакцин, в которые можно вводить предварительно очищеные химические антигены.
Типичным примером использования различных типов вакцин является вакцинация против гриппа человека. В наши дни используется несколько типов инактивированных очищенных вакцин – субвирионных из полностью разрушенных вирионов (сплит-вирусные вакцины) и субвирионных субъединичных вакцин – с наивысшей степенью очистки от балластных веществ. Таким образом, субъединичные вакцины против гриппа и парагриппа животных должны содержать в качестве субъединиц гемагглютинин и нейрамидазу. Определены и выделены в чистом виде субъединицы возбудителей ящура, адено- и герпесвирусных инфекций, против которых также получены субъединичные вакцины. Но надо помнить, что вирусные субъединичные вакцины только тогда активны, если они индуцируют вируснейтрализующие антитела.
Технологический процесс изготовления субъединичных вакцин состоит из следующих этапов: 1) получение вируса зараженных культур клеток или эмбрионов; 2) очистка вируса с помощью пластинчатого сепаратора или на колонке с сефадоксом; 3) микрофильтрация; 4) понцентрирование (примерно в 50 раз) на фильтрах; 5) дополнительная очистка ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы; 6) расщепление концентратов детергентами; 7) извлечение гликопротеинов вирусов путем ультрацентрифугирования или ультрафильтрации; 8) диализ; 9) стерилизующая фильтрация концентрата субъединиц; 10) стандартизация концентрата субъединиц; 11) контроль биопрепарата.
Преимущества: менее реактогенны, чем вакцины 1 поколения
Недостатки: слабые иммуногены и поэтому к ним для повышения эффективности добавляют адъюванты (помощники)
Рекомбинантные – их создают с помощью методов генетической инженерии. Суть метода заключается в том, что в геном вируса встраиваются гены другого микроорганизма, ответственные за образование, например, любых поверхностных структур, которые индуцируют иммунитет против организма-донора генетического материала. В зависимости от природы антигенного материала (гены или полученные в результате их экспрессии антигенные белки) различают два типа генно-инженерных вакцин — рекомбинантные живые вакцины (векторные) и рекомбинантные субъединичные вакцины (химические).
Векторные рекомбинантные вакцины получают путем встраивания в вирусный геном (вектор) генов другого вируса, которые кодируют определенные антигены. Например, в геном вируса оспы был введен ген австралийского антигена — HbsAg и таким образом создана рекомбинантная вакцина против гепатита В. Ведутся исследования, в которых в нуклеиновую кислоту вируса оспенной вакцины включаются гены гриппа, ВИЧ и др. Как векторы, кроме оспенной вакцины, могут использоваться также ДНК других вирусов — аденовирусу, вирусу простого герпеса (HSV — 1), вируса Ауэски. Безусловно, используются невирулентные штаммы вирусов, но все же при применении вирусов надо иметь в виду их латентное состояние, способность к самореактивации, трансформирующие и онкогенные свойства.
Сейчас уже проходят клинические исследования векторные вакцины против кори, японского энцефалита, геморрагической лихорадки (восточный серотип), папилломатоза, ящура, и др. С помощью вируса оспенной вакцины создаются поливалентные вакцины против разных серотипов гриппа, против кори, паротиту и др.
Субъединичные рекомбинантные вакцины получают путем экспрессии генов, которые кодируют протективные антигены, в клетках-продуцентах — бактерий, дрожжей, насекомых, млекопитающих и даже растений. Гены протективных антигенов сначала встраиваются в вирусные векторы, а те уже переносят нужный ген в клетки продуцентов. Последние при глубинном культивировании в биореакторах начинают синтезировать нужные антигены. Очищенные антигены вводятся в организм человека как субъединичная вакцина. Такие вакцины можно получать в неограниченном количестве (выход антигенов — 1-500 мг/л культуральной жидкости), они не являются живыми и корпускулярными, то есть они лишены инфекционных свойств и всех других недостатков, присущих живым векторным вакцинам. И хотя как векторы для создания субъединичных вакцин также используются вирусы (SV40, BPV, ретровирусы, бакуловируси), эти вакцины практически полностью безопасны. Большим успехом можно считать создание в США рекомбинантной субъединичной вакцины против гепатита В на основе дрожжевого продуцента.

26. Первое поколение вакцин: виды, методы получения, достоинства и недостатки. Примеры.

Первое поколение вакцин – это корпускулярные вакцины (цельномикробные, цельновирионные). Они делятся на убитые и живые.
В настоящее время из живых (аттенуированных или ослабленных) вакцин известны: ротавирусная, коревая, полиомиелитная, вакцина желтой лихорадки и лихорадки Ку.
Преимущества живых вакцин:
По механизму действия похожи на дикие штаммы;
Формируют эффективный гуморальный и клеточный иммунитет;
Легко проводить вакцинацию, так как необходимы небольшие дозы и требуется только однократная вакцинация.
Недостатки:
Содержат до 99% балласта – реактогенны (много побочных действий);
Способны вызывать мутации клеток организма;
Трудно дозируются, требуют особых условий хранения;
Есть вероятность возвращения в вирулентную форму.
Убитые (инактивированные). Убитые вакцины изготовляют из микрооргнизмов, убитых физическим (нагревание) или химическим (фенол, формалин, ацетон) методами. Из вирусных убитых вакцин известны: гриппозная инактивирвоанная жидкая; вакцина против клещевого энцефалита; вакцина против клещевой энцефалита; антирабическая; вакцина против гепатита А и В.
Преимущества:
Стабильны и безопасны;
Легко дозируются.
Недостатки:
Реактогенны;
Содержат фенол;
Требуется ревакцинация.
В состав вакцины входят:
— действующий компонент, представляющие специфические антигены,
— консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении, 86
— стабилизатор, который продлевает срок годности вакцины,
— полимерный носитель, который повышает иммуногенность антигена (АГ).
Основные этапы производства:
Накопление вирусного материала
Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. Культивирование вирусов проводят в культуре клеток, в куриных эмбрионах или в организме лабораторных животных. После накопления вирусов в клетках, следующим этапом в производстве вакцин является индикация, идентификация и
определение титра вирусного материала.
Выделение, очистка вирусного материала от балластных веществ, концентрирование вирусного материала.
Добавление консервантов, стабилизантов.
Разлив в ампулы или флаконы. Лиофилизация.
Контроль качества на чистоту (отсутствие каких-либо контаминантов), на безвредность, на реактогенность (то есть иммунную и специфичную активность), на эпизоотическую безопасность и эффективность, на стабильность при хранении.
Производство вакцин, содержащих убитые вирусы, отличается от производства живых ослабленных вакцин лишь тем, что выделенные из культуральной среды возбудители инактивируют с помощью химических соединений, например формальдегида или бета-пропиолактона. Вирусы, выделяемые из надосадочной жидкости после разрушения выращенных в культуре клеток, практически не содержат клеточных компонентов. Кроме того, больший по сравнению с другими компонентами культуральных сред размер вирусных частиц обеспечивает возможность высокой степени очистки. Эти характеристики «убитых» вакцин обеспечивают их выбор при необходимости индукции гуморального (антителозависимого) иммунитета против вирусных заболеваний.

27. Второе поколение вакцин: виды, методы получения, достоинства и недостатки. Примеры.

Ко второму поколению вакцин относят: химические вакцины (субклеточные или субъединичные) и анатоксины (в бактериологии).
Химические вакцины являются безкорпускулярними и представляют собой наборы химических веществ, которые выступают для определенного возбудителя как протективные антигены. Их получают из поверхностных и субвирионных антигенов вирусов вирусных структур с помощью разных методов экстракции и очистки: экстрагирования трихлоруксусной кислотой, обработки детергентами, осаждения антигенов спиртом, сернокислым аммонием, с использованием диализа, ультрафильтрации, афинной хроматографии и т.д.
Для повышения иммуногенности химические вакцины комбинируют с адъювантами, которыми является фосфат кальция, гидроокись алюминия, и другие. Большие перспективы связывают с созданием липосомных вакцин, в которые можно вводить предварительно очищеные химические антигены.
Типичным примером использования различных типов вакцин является вакцинация против гриппа человека. В наши дни используется несколько типов инактивированных очищенных вакцин – субвирионных из полностью разрушенных вирионов (сплит-вирусные вакцины) и субвирионных субъединичных вакцин – с наивысшей степенью очистки от балластных веществ. Таким образом, субъединичные вакцины против гриппа и парагриппа животных должны содержать в качестве субъединиц гемагглютинин и нейрамидазу. Определены и выделены в чистом виде субъединицы возбудителей ящура, адено- и герпесвирусных инфекций, против которых также получены субъединичные вакцины. Но надо помнить, что вирусные субъединичные вакцины только тогда активны, если они индуцируют вируснейтрализующие антитела.
Технологический процесс изготовления субъединичных вакцин состоит из следующих этапов: 1) получение вируса зараженных культур клеток или эмбрионов; 2) очистка вируса с помощью пластинчатого сепаратора или на колонке с сефадоксом; 3) микрофильтрация; 4) понцентрирование (примерно в 50 раз) на фильтрах; 5) дополнительная очистка ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы; 6) расщепление концентратов детергентами; 7) извлечение гликопротеинов вирусов путем ультрацентрифугирования или ультрафильтрации; 8) диализ; 9) стерилизующая фильтрация концентрата субъединиц; 10) стандартизация концентрата субъединиц; 11) контроль биопрепарата
Преимущества: менее реактогенны, чем вакцины 1 поколения
Недостатки: слабые иммуногены и поэтому к ним для повышения эффективности добавляют адъюванты (помощники)

28. Третье поколение вакцин: виды, методы получения, достоинства и недостатки. Примеры.

Их создают с помощью методов генетической инженерии. Суть метода заключается в том, что в геном вируса встраиваются гены другого микроорганизма, ответственные за образование, например, любых поверхностных структур, которые индуцируют иммунитет против организма-донора генетического материала. В зависимости от природы антигенного материала (гены или полученные в результате их экспрессии антигенные белки) различают два типа генно-инженерных вакцин — рекомбинантные живые вакцины (векторные) и рекомбинантные субъединичные вакцины (химические).
Векторные рекомбинантные вакцины получают путем встраивания в вирусный геном (вектор) генов другого вируса, которые кодируют определенные антигены. Например, в геном вируса оспы был введен ген австралийского антигена — HbsAg и таким образом создана рекомбинантная вакцина против гепатита В. Ведутся исследования, в которых в нуклеиновую кислоту вируса оспенной вакцины включаются гены гриппа, ВИЧ и др. Как векторы, кроме оспенной вакцины, могут использоваться также ДНК других вирусов — аденовирусу, вирусу простого герпеса (HSV — 1), вируса Ауэски. Безусловно, используются невирулентные штаммы вирусов, но все же при применении вирусов надо иметь в виду их латентное состояние, способность к самореактивации, трансформирующие и онкогенные свойства.
Сейчас уже проходят клинические исследования векторные вакцины против кори, японского энцефалита, геморрагической лихорадки (восточный серотип), папилломатоза, ящура, и др. С помощью вируса оспенной вакцины создаются поливалентные вакцины против разных серотипов гриппа, против кори, паротиту и др.
Субъединичные рекомбинантные вакцины получают путем экспрессии генов, которые кодируют протективные антигены, в клетках-продуцентах — бактерий, дрожжей, насекомых, млекопитающих и даже растений. Гены протективных антигенов сначала встраиваются в вирусные векторы, а те уже переносят нужный ген в клетки продуцентов. Последние при глубинном культивировании в биореакторах начинают синтезировать нужные антигены. Очищенные антигены вводятся в организм человека как субъединичная вакцина. Такие вакцины можно получать в неограниченном количестве (выход антигенов — 1-500 мг/л культуральной жидкости), они не являются живыми и корпускулярными, то есть они лишены инфекционных свойств и всех других недостатков, присущих живым векторным вакцинам. И хотя как векторы для создания субъединичных вакцин также используются вирусы (SV40, BPV, ретровирусы, бакуловируси), эти вакцины практически полностью безопасны. Большим успехом можно считать создание в США рекомбинантной субъединичной вакцины против гепатита В на основе дрожжевого продуцента.

29. Основные биотехнологические подходы к изготовлению вакцин первого поколения. Инактиванты, адъюванты, стабилизаторы.

Первое поколение вакцин – это корпускулярные вакцины (цельномикробные, цельновирионные). Они делятся на убитые и живые.
ЖИВЫЕ ВАКЦИНЫ. В настоящее время из живых (аттенуированных или ослабленных) вакцин известны: ротавирусная, коревая, полиомиелитная, вакцина желтой лихорадки и лихорадки Ку.
Преимущества живых вакцин:
По механизму действия похожи на дикие штаммы;
Формируют эффективный гуморальный и клеточный иммунитет;
Легко проводить вакцинацию, так как необходимы небольшие дозы и требуется только однократная вакцинация.
Недостатки:
Содержат до 99% балласта – реактогенны (много побочных действий);
Способны вызывать мутации клеток организма;
Трудно дозируются, требуют особых условий хранения;
Есть вероятность возвращения в вирулентную форму.

Живые вакцины готовят из аттенуированных вирусов с ослабленной или потерянной вирулентностью. Основным заданием при изготовлении живых вакцин является сохранение их антигенности и иммуногенности и снижения вирулентности. Штаммы с ослабленной вирулентностью можно получить путем селекции, в том числе с использованием мутагенеза, под воздействием бактериофагов, и др.
В состав вакцины входят:
— действующий компонент, представляющие специфические антигены,
— консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении,
— стабилизатор, который продлевает срок годности вакцины,
— полимерный носитель, который повышает иммуногенность антигена (АГ) –адъювант.
Использование адъювантов, то есть средств, которые неспецифически усиливают специфический иммунный ответ. Иначе говоря, эти препараты применяются только в сочетании с вакцинами или анатоксинами. К адъювантам принадлежат: обычно гидроокись алюминия, который создает депо и таким способом замедляет резорбцию введенного антигена и пролонгирует иммунный ответ. Препараты типа нуклеината натрия, левамизола, диуцифона, лейкинферон, миелопептиды, синтетические нуклеотиды, не создающие депо в организме, но, интенсифицируя иммунные реакции, ускоряющие образование антител. Они повышают напряженность и продлевают длительность вакцинального иммунитета.
Все производители применяют тиомерсал или формальдегид в качестве консервантов, карболовую кислоту (с конечной концентрацией 0,5%) или мертиолят (в разведении 1:10000). Некоторые производители применяют также желатин в качестве стабилизатора.
Основные этапы производства живых вакцин:
Накопление вирусного материала
Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. Культивирование вирусов проводят в культуре клеток, в куриных эмбрионах или в организме лабораторных животных. Все живые вирусные вакцины содержат не только собственные антигены, но и антигены культур тканей, на которых они выращиваются. Это очень повышает их реактогенность и предъявляет особые требования к очистке этих вакцин. В последние годы вирусы выращивают в суспензионных глубинных культурах тканей, благодаря чему вирусы накапливаются в культуральной жидкости, куда выходят гораздо меньше посторонние корпускулярные антигены.
После накопления вирусов в клетках, следующим этапом в производстве вакцин является индикация, идентификация и определение титра вирусного материала.
Выделение, очистка вирусного материала от балластных веществ, концентрирование вирусного материала.
Добавление консервантов, стабилизантов.
Разлив в ампулы или флаконы. Лиофилизация.
Контроль качества на чистоту (отсутствие каких-либо контаминантов), на безвредность, на реактогенность (то есть иммунную и специфичную активность), на эпизоотическую безопасность и эффективность, на стабильность при хранении.

УБИТЫЕ ВАКЦИНЫ. Убитые вакцины изготовляют из микрооргнизмов, убитых физическим (нагревание) или химическим (фенол, формалин, ацетон) методами. Из вирусных убитых вакцин известны: гриппозная инактивирвоанная жидкая; вакцина против клещевого энцефалита; вакцина против клещевой энцефалита; антирабическая; вакцина против гепатита А и В.
Преимущества:
Стабильны и безопасны;
Легко дозируются.
Недостатки:
Реактогенны;
Содержат фенол;
Требуется ревакцинация.
Производство вакцин, содержащих убитые вирусы, отличается от производства живых ослабленных вакцин лишь тем, что на этапе выделения вирусов проводится еще и их инактивация. Выделенные из культуральной среды возбудители инактивируют с помощью химических соединений, например формальдегида, спирта, мертиолята, или бета-пропиолактона. Вирусы, выделяемые из надосадочной жидкости после разрушения выращенных в культуре клеток, практически не содержат клеточных компонентов. Кроме того, больший по сравнению с другими компонентами культуральных сред размер вирусных частиц обеспечивает возможность высокой степени очистки. Эти характеристики «убитых» вакцин обеспечивают их выбор при необходимости индукции гуморального (антителозависимого) иммунитета против вирусных заболеваний.

30. Основные принципы диагностики вирусных болезней.

Современная вирусология обладает широким выбором средств обнаружения, культивирования и идентификации вирусов, что позволяет своевременно установить причину и характер заболевания, распознать и определить болезнь, т.е. поставить диагноз.
Своевременно и точно поставленный диагноз предопределяет успех борьбы с болезнью. Лабораторные исследования проводят независимо от предварительного диагноза. Их значение возрастает особенно в том случае, когда заболевание протекает атипично или в виде смешанной инфекции, а также при расшифровке этиологии новых, ранее неизвестных заболеваний.
Лабораторные методы диагностики вирусных инфекций основаны на обнаружении в патологическом материале возбудителей на острой стадии болезни и на выявлении прироста противовирусных антител у животных – реконвалесцентов (переболевших и выздоравливающих).
Лабораторная диагностика вирусных инфекций складывается из 3 методических направлений.
Обнаружение возбудителя или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного (быстрая диагностика).
Выделение вируса из клинического материала и его идентификации.
Серодиагностика вирусных инфекций.
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций основаны на использовании биологических свойств вирусов. Так, в РГА гемагглютинины вирусов связываются с рецепторами чувствительных эритроцитов, вызывая их агглютинацию (склеивание); РГадс основана на прикреплении эритроцитов к участкам поверхности инфицированных клеток, где локализованы гемагглютинины. Ряд методов связан с ЦПД вируса на клеточную культуру. Однако большинство тестов диагностической вирусологии — это иммунологические реакции, основанные на взаимодействии вирусных антигенов и гомологичных антител.
Выбор метода лабораторной диагностики определяется в основном характером заболевания и предполагаемым возбудителем и решается в каждом отдельном случае в зависимости от периода болезни и условий лаборатории.

35. Методы экспресс-диагностики вирусных болезней.

Быстрая диагностика позволяет обнаружить вирус или его компоненты непосредственно в пробах, взятых от больного, и дать ответ через несколько часов. Они могут быть основаны на прямом микроскопическом исследовании мазков-отпечатков пораженной ткани с целью выявления внутриклеточных телец-включений; например, при бешенстве, герпетической инфекции, ветряной оспе
и др.
Возбудитель может быть выявлен в пораженной ткани с помощью флюоресцирующих антител: в клетках эпителия слизистой оболочки верхних дыхательных путей больных респираторными инфекциями; слущенных клетках эпителия слизистой оболочки кишечника больных гастроэнтеритами; мазках-отпечатках, взятых из пораженных органов.Возбудитель обнаруживают с помощью электронной микроскопии (ЭМ) клинического материала при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудителя в пораженной ткани (104—105 частиц в 1 мл суспензии; большие концентрации вируса бывают в фекалиях лишь при ротавирусной инфекции). Большое значение приобретает метод ИЭМ, основанный на взаимодействии добавленных к материалу антител с вирусными частицами, что позволяет выявить возбудитель и его одновременно идентифицировать. Этот метод широко применяется для быстрой диагностики герпетических, ротавирусных инфекций, гепатита А и др.
Твердофазный иммунологический анализ. Другим способом является обнаружение антигена в клиническом материале с помощью серологических реакций на твердой основе. Твердофазный иммунологический анализ основан на прикреплении одного из компонентов реакции (антитела или антигена) к нерастворимому твердому носителю и последовательному добавлению других компонентов реакции в жидкой фазе. С помощью промывания можно легко отделить образующийся комплекс антиген — антитело от несвязывающихся компонентов. В зависимости от маркера, используемого для метки антигена или антитела, реакции твердофазного анализа могут быть двух категорий: с использованием радиоактивных маркеров (РИА) и ферментов (ИФА). Эти методы являются высокочувствительными, быстрыми, с высокой воспроизводимостью результатов, а ИФА является технически простым и доступным методом. Оба метода широко применяются для быстрой диагностики гепатита А и В, гастроэнтеритов (в первую очередь ротавирусных инфекций), респираторных инфекций.
Молекулярная гибридизация (МГ). Методы МГ широко используются для анализа вирусных ДНК и РНК и их взаимодействий. В настоящее время эти методы стали применять для быстрой диагностики вирусных инфекций. Их использование все более расширяется в связи с тем, что они позволяют обнаружить единичные копии генов в клеточной популяции и по степени чувствительности не имеют себе равных среди других диагностических методов.
В первую очередь методы МГ применяют для выявления персистирующих вирусов и вирусов, находящихся в клиническом материале (крови, моче, смывах носоглотки, фекалиях и т. д.), которые не размножаются в культуре клеток. Эти методы относительно просты и позволяют быстро поставить диагноз, однако их недостатком является необходимость использования чистых реактивов, которые готовят специализированные лаборатории.

36. Культивирование вирусов. Живые системы: классификация, характеристика, требования при работе. Достоинства и недостатки.

Главными среди экспериментальных объектов в вирусологии являются лабораторные животные, куриные эмбрионы, культуры животных и растительных клеток, растения-индикаторы и бактериальные культуры.
Соответственно, при исследовании вирусов человека и животных чаще всего применяются модельные системы с привлечением лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур животных клеток.
В вирусологических исследованиях лабораторных животных использовали раньше и используют сегодня с разными целями:
— для непосредственного выделения вирусов из окружающей среды;
— для выявления (индикации) вируса в патологическом материале, то есть для проведения биологической пробы;
— для накопления вирусов в значительном количестве;
— для культивирования вирусов в лабораторных условиях с целью длительного поддержания их в активном состоянии;
— для титрования вирусов, то есть установления их концентрации в патологическом материале;
— для применения их в качестве индикатора свободного вируса при
постановке реакции биологической нейтрализации;
— для получения вакцин и гипериммунных сывороток;
— для оценки эффективности профилактических и лечебных
средств;
— для изучения проявления вирусной инфекции на всех стадиях болезни, то есть патогенеза заболевания на уровне организма;
— для исследования иммунного ответа организму на поражение вирусом.
Преимущества и недостатки применения лабораторных животных. При работе с лабораторными животными нужно знать ряд негативных особенностей их использования. Сравнивая их с двумя другими экспериментальными модельными объектами вирусологических исследований, а именно куриными эмбрионами и культурами клеток, следует заметить, что содержание животных в течение эксперимента (закупка, кормление и др.) являются относительно дорогими. Кроме того, работа с животными достаточно трудоемка, при экспериментах на животных не так быстро получаются
результаты опытов.
Сегодня почти во всех вирусологических лабораториях проводят работу на куриных эмбрионах, потому что эту экспериментальную модель удобно использовать для:
— выявления вируса в патологическом материале;
— первичного выделения вируса;
— культивированиея, хранения и накопления вируса в лабораторных условиях;
— титрования вирусов;
— как тест-объекта для реакции нейтрализации;
— определения эффективности противовирусных препаратов.
В современных отраслях биотехнологии излюбленным тест-объектом для культивирования вирусов являются клеточные культуры, использующиеся для:
1. Первичного выделения вирусов с окружающей среды или из патологического материала;
2. Накопления вирусов (например, при изготовлении вакцин и диагностикумов);
3. Поддержания штаммов вирусов в лабораторных условиях;
4. Определения инфекционного титра вирусов;
5. Изучения динамики взаимодействия вирусов и клеток;
6. Идентификации вирусов;
7. Как тест-объект в реакции нейтрализации;
8. Изучения действия антивирусных веществ.
Список типов клеток, которые в настоящее время возможно культивировать, достаточно большой. Это элементы соединительной ткани (фибробласты), скелетные ткани (кости и хрящи), скелетные, сердечные, но гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почки), клетки нервной системы (глиальные клетки и нейроны, хотя последние не имеют способности к пролиферации), эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоцит и много разных типов клеток опухолей.
Классификация клеток, которые культивируются in vitro, связана из определенными трудностями. В последнее время термин «культура ткани» превратился на общее понятие, которое включает в себя как органную культуру, в которой наибольшие фрагменты ткани или целые эмбриональные органы эксплантируются с сохранением тканевой архитектуры, так и культуры клеток, ткани которых диспергируются механически, ферментативным или путем спонтанной миграции клеток из экспланта, и клетки, присоединившиеся к субстрату, размножаются в виде суспензии или монослоя.
Органная культура (культура тканей) сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение длительного периода сохраняет гистологическое и биохимическое дифференцирование и после начальной травмы остается, как правило, в нерастущем равновесном состоянии в течение нескольких суток и даже недель. Эти культуры не всегда способны к размножению.
Культуры клеток, напротив, лишенные структурной организации, теряют характерную гистологическую архитектуру и связанные с ней биохимические признаки и, как правило, не достигают равновесного состояния при отсутствии специфических условий. Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток и их разделения на идентичные параллели.
Бактериальные вирусы (бактериофаги) представляют собой относительно
простую биологическую систему и является удобной моделью для изучения основных проблем молекулярной биологии, молекулярной генетики и тому подобное. Значительные успехи в изучении механизмов репликации нуклеиновых кислот, исследования тонкой структуры генетического материала, молекулярного механизма мутаций, регуляции белкового синтеза связаны с применением бактериофагов как удобных модельных объектов. Это удобство заключается в следующем:
1) бактериофаги имеют простую, но дифференцированную структурную организацию, которая на сегодня хорошо изученной;
2) они быстро размножаются;
3) известны достаточно надежные методы накопления, выделения и
очистки бактериофагов;
4) благодаря простоте организации бактериальных клеток накоплена много информация относительно их молекулярно-биологических и генетических характеристик, потому модель фаг-бактерия широко применяется в современной молекулярной биологии.
Бактериофаги, как и другие вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами и размножаются исключительно в клетках бактерий. Их размножение в жидкой среде приводит к тому, что культура, которая была мутной перед добавлением вируса, через несколько часов инкубации становится прозрачной.
На твердых средах фаги выявляют при помощи бляшкового метода. При этом на поверхность агара в чашке Петри засевают культуру, а потом на нее наносят каплю вируссодержащего материала. На месте нанесения материала будут или отдельные негативные колонии, или большое стерильное пятно, в зависимости от количества вируса в исследуемом образце. Для точного определения титра вируса применяют методы титрования бактерофагов по методу Апельмана (в жидкой питательной среде) и Грациа (метод двойных агаровых слоев).
Фитовирусы отличаются по способности инфицировать разные растения: количество чувствительных растений варьирует у разных вирусов. Круг хазяев вируса и симптомы, какие они вызывают, являются характерными признаками для данного вируса и используются наряду с другими для идентификации вируса. Вирусная инфекция проявляется во внешнем виде растения, хотя по сути, это отражение внутриклеточных изменений, вызванных вирусом.
Симптомы поражения могут быть разными и зависят от растения-хозяина, длительности инфекции, штамма вируса и условий внешней среды. Например, симптомы заболевания наиболее четко выражены у растений, которые выращены при ярком свете при умеренной температуре. Для идентификации вирусов по визуальным симптомам используют так называемые растения-индикаторы. Заражение их проводят механическим способом.

37. Тропизм вируса. Выбор способа заражения живой системы. Методы заражения куриных эмбрионов.

Выбор метода поражения определяется тропизмом вируса. Под тропизмом понимают способность вируса реплицироваться в определенных типах клеток организма. Вирусы, которые репродуцируются в нервных клетках, называют нейротропными (например, вирус бешенства), в клетках кожи — дерматропными (вирус оспы), в клетках дыхательных путей — пневмотропными (вирус гриппа), в клетках желудочно-кишечного тракта — энтеротропными (вирус гепатита А). Вирусы, которые способны реплицироваться в нескольких типах клеток, называют политропными (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота — клетки органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток — пантропными (вирус чумы собак). Такая классификация вирусов по тропизму называется классификацией вирусов человека и животных по Хюбнеру.
Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, которые содержат чувствительные к данному вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят в дыхательные пути интраназально (через нос), вирус оспы в кожу — подкожно, внутрикожно или накожно), вирус бешенства в мозг — интрацеребрально. Пантропные вирусы быстрее распространяются по организму при их введении внутривенно или внутрибрюшинно. Если тропизм вируса неизвестен, то используют несколько групп животных для поражения разными методами. При этом в зависимости от способа заражения животного одним и тем же вирусом используется разный объем вируссодержащей суспензии.
В вирусологической практике куриные эмбрионы используют по большей части для выделения вирусов из клинического и секционного материала, культивирования лабораторных штаммов возбудителей, приготовления диагностических препаратов и первично-трипсинированной культуры клеток, а также для получения вакцин.
Для выделения вирусов применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 12-14 дней. При этом возраст эмбрионов, способ их заражения и сроки получения максимального количества вирусов (время инкубации) зависят от биологических особенностей культивируемых вирусов и их тропизма.
Перед работой куриные эмбрионы выдерживают в термостате при температуре 37°С и относительной влажности 60-70%, что поддерживается наличием в термостате лотков с водой. Чтобы эмбрионные оболочки не слипались, яйца время от времени переворачивают (в термостате — вручную, несколько раз на день).
Во время пассажей лабораторных штаммов вирусов на куриных эмбрионах важно придерживаться найденной эмпирически оптимальной дозы возбудителя. Так, для вируса гриппа она колеблется в пределах 100 — 1 000 ЭИД50 (ЭИД50 — эмбриональная инфекционная доза с 50% эффектом, она равна наименьшему количеству вирусных частиц, которые репродуцируются в 50% взятых для заражения куриных эмбрионов), для вируса паротита — 10-100 ЭИД50 и т. д.
Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют для определения их жизнеспособности. Признаки живого эмбриона — наличие самостоятельных движений, хорошо выражен сосудистый рисунок, пульсация сосудов.
Во время овоскопии устанавливают и отмечают на скорлупе границу воздушного мешка, место расположения эмбриона («темный глаз» эмбриона) или делают другие отметки, необходимые для заражения избранным методом.
Существует несколько способов заражения куриного эмбриона: в полость амниона и алантоиса, на хорион-аллантоисну оболочку, в желточный мешок.
Объем исследуемого материала, который вводится в эмбрион, составляет 0,1 — 0,2мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не меньше чем 4 куриных эмбриона.
Заражение в полость алантоиса. Полость алантоиса — это орган выделения эмбриона, заполненный жидкостью, которая содержит изотонический раствор разных солей. Алантоис окружает эмбрион и желточный мешок, располагаясь на внутренней поверхности скорлупы, под хорионом. По мере развития эмбриона алантоис значительно увеличивается, достигая максимума по объему алантоисной жидкости (до 7 — 10 мл) на 11-13 — й день.
Техника заражения куриного эмбриона достаточно простая. В центре тупого конца вертикально размещенного яйца над воздушным мешком прокалывают скорлупу, вводят иглу для внутримышечных инъекций на 2-3 мм ниже границы воздушного мешка и туберкулиновым шприцем впрыскивают исследуемый материал.
Второй способ заражения в полость алантоиса заключается в следующем. Материал вводят в боковую часть эмбриона, размещая яйцо горизонтально. При этом скорлупу прокалывают дважды: в участке воздушного мешка и на боковой поверхности эмбриона, где в алантоисе нет больших кровеносных сосудов. В место бокового прокола вводят иглу туберкулинового шприца на глубину 2-3 мм и проводят заражение.
После окончания работы проколы в скорлупе закрывают расплавленным парафином.
Заражение в полость амниона. В полости амниона находится сам эмбрион, и вирусосодержащий материал, введенный в эту полость, попадает в его дыхательные пути. Амниотическая жидкость — это изотонический раствор солей, который в процессе развития эмбриона обогащается белком. Объем ее около 1 мл. Первый способ заражения эмбриона в полость амниона — открытый. Над воздушным мешком вертикально размещенного яйца прорезают окошко размером 1×1 см и осторожно снимают часть хорион-алантоисной оболочки над телом эмбриона. Потом глазным пинцетом, минимально травмируя ткани, захватывают амнион и подтягивают его вверх. После этого амнион перехватывают пинцетом с плоскими браншами левой рукой, а правой с помощью туберкулинового шприца вводят исследуемый материал. После заражения эмбриона отверстие в скорлупе закрывают стерильной полиэтиленовой пленкой или часовым стеклом с помощью парафина.
Второй способ заражения — закрытый. Заражение проводят с помощью овоскопа в затемненном боксе. Материал вводят через прокол в скорлупе в участке тупого конца вертикально размещенного яйца. При этом иглу направляют на «темный глаз» эмбриона, отклоняя ее от центральной оси яйца, или, если есть прокол над воздушным мешком, делают прокол и на боковой поверхности горизонтально размещенного яйца и вводят иглу в направлении к телу эмбриона. Если материал введен правильно, тень эмбриона смещается. Отверстия закрывают.
Заражение в хорион-алантоисную оболочку. Первый способ заражения такой. Над воздушным мешком вертикально размещенного яйца вырезают кусочек скорлупы (окошко), потом отслаивают оболочку под скорлупой, обнажая участок хорион-алантоисной оболочки, на который наносят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе запаивают расплавленным парафином. Описанный способ технически простой, но можно повреждить хорион-алантоисную оболочку, потому лучше проводить заражение иным способом.
Второй способ заключается в создании искусственного воздушного мешка на боковой поверхности яйца в том месте, где хорион-алантоисная оболочка свободна от больших кровеносных сосудов (его помечают карандашом). Для этого в обозначенном участке скорлупы выпиливают щель длиной 6 — 8 мм и в ширину 2 мм так, чтобы оболочка под скорлупой осталась невредимой. На тупом конце яйца над естественным воздушным мешком делают прокол.
На обнаженную оболочку под скорлупой наносят каплю стерильного изотонического раствора натрий хлорида (комнатной температуры) и через нее делают в оболочке разрыв с помощью пера для взятия крови или специальной иглой с загнутым концом. Разрывать оболочку под скорлупой надо осторожно, чтобы не травмировать хорион-алантоисную оболочку, которая плотно прилегает к ней. Во время разрыва оболочки под скорлупой капля изотонического раствора попадает внутрь, поскольку хорион-алантоисная оболочка отслаивается и опускается, формируя новый воздушный мешок, его размеры увеличивают, отсасывая воздух резиновой грушей сквозь прокол на тупом конце яйца. Образования искусственного воздушного мешка контролируют с помощью овоскопа.
На хорион-алантоисную оболочку воздушного мешка наносят исследуемый материал, равномерно распределяют по ней, отверстие заливают парафином. Прокол на тупом конце яйца закрывают парафином. Яйца инкубируют так, чтобы искусственный воздушный мешок очутился сверху.
Заражение в желточный мешок. Яйцо кладут на подставку горизонтально так, чтобы тело эмбриона было внизу, а желток — над ним. Иглой для внутримышечных инъекций в скорлупе делают прокол в участке воздушного мешка (глубина проникновения — 2/3 длины иглы) по центральной оси яйца, шприцем вводят исследуемый материал. Отверстие закрывают парафином.
После заражения эмбрионы инкубируют в термостате, размещая их тупым концом кверху. Температура и длительность инкубации зависят от биологических свойств вируса.

38. Культура клеток. Классификация. Получение первичной культуры клеток. Сравнительная характеристика разных видов стационарных многослойных культур клеток.

В современных отраслях биотехнологии излюбленным тест-объектом для культивирования вирусов являются клеточные культуры, использующиеся для:
1. Первичного выделения вирусов с окружающей среды или из патологического материала;
2. Накопления вирусов (например, при изготовлении вакцин и диагностикумов);
3. Поддержания штаммов вирусов в лабораторных условиях;
4. Определения инфекционного титра вирусов;
5. Изучения динамики взаимодействия вирусов и клеток;
6. Идентификации вирусов;
7. Как тест-объект в реакции нейтрализации;
8. Изучения действия антивирусных веществ.
Список типов клеток, которые в настоящее время возможно культивировать, достаточно большой. Это элементы соединительной ткани (фибробласты), скелетные ткани (кости и хрящи), скелетные, сердечные, но гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почки), клетки нервной системы (глиальные клетки и нейроны, хотя последние не имеют способности к пролиферации), эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоцит и много разных типов клеток опухолей.
Классификация клеток, которые культивируются in vitro, связана из определенными трудностями. В последнее время термин «культура ткани» превратился на общее понятие, которое включает в себя как органную культуру, в которой наибольшие фрагменты ткани или целые эмбриональные органы эксплантируются с сохранением тканевой архитектуры, так и культуры клеток, ткани которых диспергируются механически, ферментативным или путем спонтанной миграции клеток из экспланта, и клетки, присоединившиеся к субстрату, размножаются в виде суспензии или монослоя.
Органная культура (культура тканей) сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение длительного периода сохраняет гистологическое и биохимическое дифференцирование и после начальной травмы остается, как правило, в нерастущем равновесном состоянии в течение нескольких суток и даже недель. Эти культуры не всегда способны к размножению.
Культуры клеток, напротив, лишенные структурной организации, теряют характерную гистологическую архитектуру и связанные с ней биохимические признаки и, как правило, не достигают равновесного состояния при отсутствии специфических условий. Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток и их разделения на идентичные параллели.
Принцип метода однослойных культур клеток заключается в выращивании клеток, полученных, как правило, путем ферментативной дезинтеграции на стеклянной поверхности в виде монослоя, и базируется на явлении адгезии — способности клеток прикрепляться к стеклянной поверхности. К однослойным культурам относят первичные, или первично-трипсинизированные, диплоидные, гетероплоидные и перевиваемые культуры клеток.
Первичная культура клеток (первично-трипсинизированная культура) — культура, которая происходит от клеток и органов, взятых непосредственно из организма. Для получения первичных культур клеток используют разнообразные ткани и органы человека и животных. После соответствующей обработки их измельчают на фрагменты 1-2 мм и обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсин, версен), которые разрушают межклеточные связи, в результате чего получают взвесь отдельных клеток, которые легко подсчитать.
Для ферментативной дезинтеграции применяют метод с использованием холодного или теплого трипсина.
Метод с использованием теплого трипсина заключается в том, что кусочки ткани или целые органы эмбриона помещают в 0,25 % раствор трипсина при температуре 37°С. Во время пипетирования в теплом трипсине происходит их дезагрегация на отдельные клетки. Порции клеток собирают по мере их выделения, центрифугируют, трипсин сливают, вносят среду роста и суспендируют в ней клетки. Принцип метода использования холодного трипсина таков. Кусочки тканей заливают 0,25 % раствором трипсина и оставляют на ночь при температуре 4°С. Потом раствор трипсина с кусочками тканей подогревают до 37°С, выдерживают несколько минут и быстро пипетируют; суспензию центрифугируют, трипсин сливают, клетки медленно пипетируют в среде роста и определяют их количество в счетной камере Горяєва.
Культуры называют первичными до начала пассажей.

Органные культуры в какой-то степени сохраняют тканевые взаимоотношения клеток, близкие к таковым в органах ж-ных. Мелкие кусочки органов помещают на “плот” (желточная оболочка куриного эмбриона, спец. сорт бумаги, вискоза, миллипоровые фильтры и др.), плавающий в жидкой питат. среде или фиксированный на плотной среде.
Органная культура — культивирование in vitro органа или части органа, в которых сохраняются анатомическая связь и функционирование тканей, максимально приближенные к таковым в условиях in vivo, то есть в организме. Миграция изолированных клеток на периферии экспланта подавляется специальными условиями культивирования, в результате чего могут даже образовываться дифференцированные структуры. Например, на периферии эксплантов легочной ткани развиваются новые мелкие бронхи, состоящие из альвеол, окаймленных бронхиальным эпителием.
Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода поддерживает гистологическую и гистохимическую дифференцировку, как правило, остается в не растущем состоянии в течение нескольких дней и даже недель. Эти культуры не способны к размножению.
Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, эндокринные органы продолжают секрецию специфических гормонов и т.д. Наибольшее сходство процессов морфогенеза in vivo и in vitro отмечено для эмбриональных тканей.
Существует несколько видов техники культивирования органов. В качестве субстрата можно использовать сгусток плазмы. Этот способ был предложен Феллом и Робинсоном и получил название «техника часового стекла», став классической техникой морфогенетического анализа эмбриональных органов. Культивирование проводят во впадине часового стекла на поверхности сгустка, состоящего из плазмы цыпленка и эмбрионального экстракта кур. Часовое стекло помещают в чашку Петри и закрывают сверху влажной ватой или фильтровальной бумагой для предотвращения высыхания. Культивируют в термостате при 37,5оС. Существуют модификации этого метода, при которых часовое стекло покрывается крышкой, приклеенной воском и другие. Недостатком метода, ограничивающим применение его в биологических исследованиях, является разжижение сгустка в окрестностях экспланта, который в результате оказывается в жидкости. Кроме того, сложный состав среды затрудняет проведение биохимических исследований.
Эти недостатки устраняются при использовании сгустка агара. Такая техника была предложена Спраттом. Метод основан на получении агарового геля 1-4% концентрации, основу которого составляют забуференные солевые растворы или питательные среды типа 199 с добавлением эмбриональной сыворотки.
В середине 20-го века Чен обнаружил, что культуры можно выращивать на бумажных плотиках, плавающих на поверхности жидкости в часовом стекле. С целью улучшения техники позднее бумагу обрабатывали силиконом, комбинировали с миллипоровыми фильтрами, а затем перешли на плотики из ацетата вискозы. Этот материал хорошо растворяется в ацетоне, что облегчает подготовку ткани для гистологического анализа.
Метод культивирования на плотиках не лишен недостатков, основной из них — погружение ткани в среду при затоплении плотика. Решение этой проблемы было предложено Троувеллом, который предложил культивировать органы на поверхности металлической сетки. Сетка представляет собой квадрат размерами 25*25 мм с отогнутыми краями, образующими четыре ножки высотой около 4 мм. Скелетные ткани культивируют непосредственно на сетке, тогда как мягкие вначале эксплантируются на бумагу, а затем помещаются на сетку.
В 1976 году, для длительного культивирования взрослых тканей человека, таких как эпителий бронхов и молочной железы, пищевод и др. был предложен метод поочередного культивирования в жидкой среде и газовой фазе. Для этого экспланты прикрепляются ко дну пластикового сосуда и покрываются средой. Сосуды помещают в камеру с определенным газовым составом, а камера помещается на качающуюся платформу.

39. Перевиваемая культура клеток. Получение, поддержание, свойства. Преимущества перед первичной культурой клеток. Методика биопробы на перевиваемой культуре.

Постоянная (непрерывная, перевиваемая) культура клеток состоит из клеток одного типа, которые способны расти вне организма в течение неограниченного числа пассажей. Постоянные клеточные линии получают из опухолевых или нормальных тканей человека или животных, которые имеют измененный (трансформируемый) кариотип. Использование постоянных культур клеток в вирусологической практике имеет определенные преимущества по сравнению с первичными и диплоидными культурами клеток.
Преимущества: способность к неограниченному размножению, экономичность, широкий спектр чувствительности вирусов, по сравнению с первичными КК, обеспечение стандартных условий для размножения вирусов по сравнению с первичными КК. К недостаткам относят: возможность малигнизации (злокачественного перерождения), быстрое снижение чувствительности к вирусам по сравнению с первичными КК.
Перевиваемые культуры клеток выращивают в виде суспензий (со стационарной или проточной системой представления питательной среды) или однослойных культур на поверхности стекла в сосудах, матрасах, пробирках, панелях. В последнем случае необходимо систематическое проведение пассажей (посевы) клеток с использованием для этого культур предыдущего пассажа или музейных клеток, которые хранятся в условиях консервирования. Полноценную популяцию клеток можно получить лишь при условии использования жизнеспособных клеток.
Отобранную для пересева культуру клеток отделяют от стекла с помощью трипсина (0,25 %), версена (0,2 %), химопсина (0,02 %) или механически, соскребая и измельчая полученные клетки с помощью многократного пипетирования. В случае использования версена отделение клеток от стекла и формирования суспензии проводят при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Если взрыхление слоя клеток достаточно и началось отделение его от стекла, раствор версена сливают, а в матрасы заливают среду роста. Ею старательно смывают клетки со стекла сосуда. Полученную суспензию клеток после подсчета в счетной камере Горяева разводят средой роста к концентрации, необходимой для посева. Например, во флаконы вместимостью 100 мл, разливают по 20 мл взвеси, которая содержит 40-60 тыс. клеток в 1 мл. Формирование монослоя клеток происходит за 48 часов.
С целью накопления большого количества вирусов в культуре клеток (например, при изготовлении вакцин и диагностикумов); для поддержания штаммов вирусов в лабораторных условиях; для изучения динамики взаимодействия вирусов и клеток; изучения действия антивирусных веществ и др. проводят заражение вирусом культуры клеток.
Перед внесением вируссодержащего материала питательную среду роста сливают, монослой промывают раствором Хенкса, пробирки маркируют. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл исследуемого материала и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 1 часа для адсорбции вируса на клетках. После 1-2-часового контакта материал сливают, монослой промывают раствором Хенкса для удаления токсичных компонентов, заливают поддерживающей средой и выдерживают в термостате при температуре 37°С 7-14 дней до получения результатов (в зависимости от цели). Для поддержания клеточной культуры можно использовать среду 199 из 2 % сыворотки крови крупного рогатого скота, среду Игла из 2 % сыворотки, раствор Эрла с 0,5 % гидролизатом лактальбумина и 1-2 % сыворотки крови. В зараженных культурах клеток рН (6,9-7,4) поддерживают с помощью 7,5 % стерильного раствора натрий гидрокарбоната. Если культивирование зараженных культур длительно, то периодически меняют поддерживающую среду, сливают старую и добавляют новую.

40. Признаки репродукции вирусов в живых системах: лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток.

Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса при заражении лабораторных животных, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительных серологических реакций.
Показателем поражения эмбриона вирусом является его гибель в характерные для вируса сроки, а также патологоанатомические изменения, которые появляются в разных структурах эмбриона. Например, ХАО может иметь отек, кровоизлияния, узлы. Такие изменения наблюдаются при поражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауэски и др. Сам зародыш при этом может отставать в росте и развитии, то есть появляется феномен карликовости. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Например, набрякшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона является признаком размножения в нем вируса гепатита гусей.
Встречаются такие вирусы (например, штамм В1 вируса Ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибель, ни патологоанатомические изменения. Выявить такой вирус возможно только при постановке реакции гемагглютинации или иммуноферментного анализа.
Иногда при вскрытии эмбриона не удается выявить признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пассаж называют «слепым». Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации – склеиванию эритроцитов.
В культуре клеток обнаруживают цитопатическое действие вирусов – это морфологические изменения, которые возникают во время взаимодействия вируса и клетки. Период развития и характер цитопатических изменений, вызванных цитопатогенными вирусами в инфицированных культурах клеток, определяются: 1) свойством вируса, 2) дозой вируса; 3) свойствами клеток и условиями их культивирования.
Характерные для каждого вируса цитопатические изменения развиваются в культурах клеток, зараженных средними дозами вируса, — 1 000-10 000 ЦПД50 (ЦПД50-цитопатическая доза вируса, которая приводит к дегенерации в 50 % пробирок с зараженной культурой клеток). Если дозы вируса большие или малые, морфологические изменения в клетках бывают нетипичными: значительные дозы вирусов вызывают развитие некроза с полным отслаиванием разрушенных клеток от стекла, а незначительные – медленную очаговую дегенерацию клеток.
Выделяют 3 основных вида изменений в случае заражения культур клеток:
1. Образование многоядерных гигантских клеток, синцитиев и симпластов, представляющих результат слияния цитоплазмы многих клеток и амитотического деления.
2. Круглоклеточная дегенерация (пикноз, сморщивание, деструкция клеток), которая возникает в результате разрушения межклеточных связей.
3. Развитие ячеек клеточной пролиферации, которые состоят из нескольких слоев клеток.
Степень дегенерации клеток оценивают знаком «плюс»: (4+) -деструкция всех клеток (100%); (3+) — большинства клеток (75%); (2+) — половины клеток (50%).
Характерным для ЦПД многих вирусов является формирование внутриядерных и цитоплазматических включений. Динамика их формирования, их форма, размер, субклеточная организация, наличие в них вирусоспецифических нуклеиновых кислот и белков имеют важное диагностическое значение, поскольку отличаются у вирусов разных таксономических групп.
Включение можно выявить в окрашенных или обработанных флюорохромами препаратах.
Их классифицируют по локализации в клетке, содержанию нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности (гомогенные или зернистые). Тельца-включения локализуются избирательно. Одни – в цитоплазме (при оспе (тельца Гварниери), бешенстве (тельца Бабеша-Негре), гриппе, парагриппе, чуме крупного рогатого скота), другие – в ядре (при ринотрахеите крупного рогатого скота, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции, герпесвирусной инфекции (тельца Каудри)). По отношению к красителям включения делят на базофильные (красятся основными красителями – азур, пироксин) и ацидофильные (красятся кислыми красителями – эозин, кислый фуксин). По своей природе включения могут быть местами образования вирусных частиц (фабрики вирионов – тельца Гварниери), накоплением вирусов (тельца Бабеша — Негре), глыбками хроматина (тельца Каудри).
Просмотр зараженных вирусом клеток проводят под малым увеличением микроскопа. Размножение некоторых вирусов (энтеровирусов, арбовирусов, миксовирусов и др.) в культуре клеток можно выявить методом бляшек. В основе метода лежит появление в монослое зараженных клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков (бляшек). Бляшки представляют собой деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться в отличие от живых клеток.
Также проводят реакцию гемагглютинации – способность склеивания эритроцитов в присутствии вируса. В качестве исследуемого материала при геамагглютинации используют аллантоисную и амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куриного эмбриона, взвеси и экстракты из органов животных, а также культуральную жидкость инфицированных клеток.
Кроме гемагглютинации применяют реакцию гемадсорбции. Сущность реакции гемадсорбции состоит в том, что на поверхности клеток, инфицированных вирусами, обладающими гемадсорбирующей активностью, адсорбируются эритроциты. Реакция гемадсорбции применяется при диагностики гриппа, парагриппа, клещевого энцефалита, оспы.
Заражение клеточных культур цитопатогенным вирусом ведет к подавлению их метаболизма. Последнее можно определить колориметрическим методом (цветной пробой). Свежая питательная среда pH 7,4-7,8, содержащая феноловый красный, имеет красный цвет. Растущие клетки в процессе метаболизма продуцируют кислоту, что приводит к изменению цвета питательной среды на желтый. При заражении вирусом клетки погибают раньше, чем вырабатывают достаточное количество кислоты, чтобы изменить цвет среды на желтый. Таким образом красный цвет среды указывает на размножение вируса, желтый – на отсутствие вируса.

41. Индикация вирусов в культуре клеток: заражение, видимые изменения и методы их контроля.

Заражение.
С целью накопления большого количества вирусов в культуре клеток (например, при изготовлении вакцин и диагностикумов); для поддержания штаммов вирусов в лабораторных условиях; для изучения динамики взаимодействия вирусов и клеток; изучения действия антивирусных веществ и др. проводят заражение вирусом культуры клеток.
Перед внесением вируссодержащего материала питательную среду роста сливают, монослой промывают раствором Хенкса, пробирки маркируют. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл исследуемого материала и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 1 часа для адсорбции вируса на клетках. После 1-2-часового контакта материал сливают, монослой промывают раствором Хенкса для удаления токсичных компонентов, заливают поддерживающей средой и выдерживают в термостате при температуре 37°С 7-14 дней до получения результатов (в зависимости от цели). Для поддержания клеточной культуры можно использовать среду 199 из 2 % сыворотки крови крупного рогатого скота, среду Игла из 2 % сыворотки, раствор Эрла с 0,5 % гидролизатом лактальбумина и 1-2 % сыворотки крови. В зараженных культурах клеток рН (6,9-7,4) поддерживают с помощью 7,5 % стерильного раствора натрий гидрокарбоната. Если культивирование зараженных культур длительно, то периодически меняют поддерживающую среду, сливают старую и добавляют новую.
Индикация.
В культуре клеток обнаруживают цитопатическое действие вирусов – это морфологические изменения, которые возникают во время взаимодействия вируса и клетки. Период развития и характер цитопатических изменений, вызванных цитопатогенными вирусами в инфицированных культурах клеток, определяются: 1) свойством вируса, 2) дозой вируса; 3) свойствами клеток и условиями их культивирования.
Характерные для каждого вируса цитопатические изменения развиваются в культурах клеток, зараженных средними дозами вируса, — 1 000-10 000 ЦПД50 (ЦПД50-цитопатическая доза вируса, которая приводит к дегенерации в 50 % пробирок с зараженной культурой клеток). Если дозы вируса большие или малые, морфологические изменения в клетках бывают нетипичными: значительные дозы вирусов вызывают развитие некроза с полным отслаиванием разрушенных клеток от стекла, а незначительные – медленную очаговую дегенерацию клеток.
Выделяют 3 основных вида изменений в случае заражения культур клеток:
1. Образование многоядерных гигантских клеток, синцитиев и симпластов, представляющих результат слияния цитоплазмы многих клеток и амитотического деления.
2. Круглоклеточная дегенерация (пикноз, сморщивание, деструкция клеток), которая возникает в результате разрушения межклеточных связей.
3. Развитие ячеек клеточной пролиферации, которые состоят из нескольких слоев клеток.
Степень дегенерации клеток оценивают знаком «плюс»: (4+) -деструкция всех клеток (100%); (3+) — большинства клеток (75%); (2+) — половины клеток (50%).
Характерным для ЦПД многих вирусов является формирование внутриядерных и цитоплазматических включений. Для их обнаружения культуры клеток выращивают на специальных стеклянных пластинках, помещенных в стерильные пробирки с 2 мл клеточной суспензии. После образования монослоя клетки заражают вирусом и через определенные сроки в зависимости от свойств исследуемого вируса готовят препараты. Для морфологических исследований культуры клеток окрашивают обычными красителями.
Динамика формирования включений, их форма, размер, субклеточная организация, наличие в них вирусоспецифических нуклеиновых кислот и белков имеют важное диагностическое значение, поскольку отличаются у вирусов разных таксономических групп.
Включение можно выявить в окрашенных или обработанных флюорохромами препаратах.
Их классифицируют по локализации в клетке, содержанию нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности (гомогенные или зернистые). Тельца-включения локализуются избирательно. Одни – в цитоплазме (при оспе (тельца Гварниери), бешенстве (тельца Бабеша-Негре), гриппе, парагриппе, чуме крупного рогатого скота), другие – в ядре (при ринотрахеите крупного рогатого скота, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции, герпесвирусной инфекции (тельца Каудри)). По отношению к красителям включения делят на базофильные (красятся основными красителями – азур, пироксин) и ацидофильные (красятся кислыми красителями – эозин, кислый фуксин). По своей природе включения могут быть местами образования вирусных частиц (фабрики вирионов – тельца Гварниери), накоплением вирусов (тельца Бабеша — Негре), глыбками хроматина (тельца Каудри).
Просмотр зараженных вирусом клеток проводят под малым увеличением микроскопа.
Размножение некоторых вирусов (энтеровирусов, арбовирусов, миксовирусов и др.) в культуре клеток можно выявить методом бляшек. В основе метода лежит появление в монослое зараженных клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков (бляшек). Бляшки представляют собой деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться в отличие от живых клеток.
Также проводят реакцию гемагглютинации – способность склеивания эритроцитов в присутствии вируса. В качестве исследуемого материала используют культуральную жидкость инфицированных клеток.
Кроме гемагглютинации применяют реакцию гемадсорбции. Сущность реакции гемадсорбции состоит в том, что на поверхности клеток, инфицированных вирусами, обладающими гемадсорбирующей активностью, адсорбируются эритроциты. Реакция гемадсорбции применяется при диагностике гриппа, парагриппа, клещевого энцефалита, оспы.
Заражение клеточных культур цитопатогенным вирусом ведет к подавлению их метаболизма. Последнее можно определить колориметрическим методом (цветной пробой). Свежая питательная среда pH 7,4-7,8, содержащая феноловый красный, имеет красный цвет. Растущие клетки в процессе метаболизма продуцируют кислоту, что приводит к изменению цвета питательной среды на желтый. При заражении вирусом клетки погибают раньше, чем вырабатывают достаточное количество кислоты, чтобы изменить цвет среды на желтый. Таким образом красный цвет среды указывает на размножение вируса, желтый – на отсутствие вируса.

42. Индикация вируса в куриных эмбрионах: заражение, признаки репродукции вирусов. Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов.

В вирусологической практике куриные эмбрионы используют по большей части для выделения вирусов из клинического и секционного материала, культивирования лабораторных штаммов возбудителей, приготовления диагностических препаратов и первично-трипсинизированной культуры клеток, а также для получения вакцин.
Для выделения вирусов применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 12-14 дней. При этом возраст эмбрионов, способ их заражения и сроки получения максимального количества вирусов (время инкубации) зависят от биологических особенностей культивируемых вирусов и их тропизма.
Перед работой куриные эмбрионы выдерживают в термостате при температуре 37°С и относительной влажности 60-70%, что поддерживается наличием в термостате лотков с водой. Чтобы эмбрионные оболочки не слипались, яйца время от времени переворачивают (в термостате — вручную, несколько раз на день).
Во время пассажей лабораторных штаммов вирусов на куриных эмбрионах важно придерживаться найденной эмпирически оптимальной дозы возбудителя. Так, для вируса гриппа она колеблется в пределах 100 — 1 000 ЭИД50 (ЭИД50 — эмбриональная инфекционная доза с 50% эффектом, она равна наименьшему количеству вирусных частиц, которые репродуцируются в 50% взятых для заражения куриных эмбрионов), для вируса паротита — 10-100 ЭИД50 и т. д.
Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют для определения их жизнеспособности. Признаки живого эмбриона — наличие самостоятельных движений, хорошо выражен сосудистый рисунок, пульсация сосудов.
Во время овоскопии устанавливают и отмечают на скорлупе границу воздушного мешка, место расположения эмбриона («темный глаз» эмбриона) или делают другие отметки, необходимые для заражения избранным методом.
Существует несколько способов заражения куриного эмбриона: в полость амниона и алантоиса, на хорион-аллантоисну оболочку, в желточный мешок.
Объем исследуемого материала, который вводится в эмбрион, составляет 0,1 — 0,2мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не меньше чем 4 куриных эмбриона.
Заражение в полость алантоиса. Полость алантоиса — это орган выделения эмбриона, заполненный жидкостью, которая содержит изотонический раствор разных солей. Алантоис окружает эмбрион и желточный мешок, располагаясь на внутренней поверхности скорлупы, под хорионом. По мере развития эмбриона алантоис значительно увеличивается, достигая максимума по объему алантоисной жидкости (до 7 — 10 мл) на 11-13 — й день.
Техника заражения куриного эмбриона достаточно простая. В центре тупого конца вертикально размещенного яйца над воздушным мешком прокалывают скорлупу, вводят иглу для внутримышечных инъекций на 2-3 мм ниже границы воздушного мешка и туберкулиновым шприцем впрыскивают исследуемый материал.
Второй способ заражения в полость алантоиса заключается в следующем. Материал вводят в боковую часть эмбриона, размещая яйцо горизонтально. При этом скорлупу прокалывают дважды: в участке воздушного мешка и на боковой поверхности эмбриона, где в алантоисе нет больших кровеносных сосудов. В место бокового прокола вводят иглу туберкулинового шприца на глубину 2-3 мм и проводят заражение.
После окончания работы проколы в скорлупе закрывают расплавленным парафином.
Заражение в полость амниона. В полости амниона находится сам эмбрион, и вирусосодержащий материал, введенный в эту полость, попадает в его дыхательные пути. Амниотическая жидкость — это изотонический раствор солей, который в процессе развития эмбриона обогащается белком. Объем ее около 1 мл. Первый способ заражения эмбриона в полость амниона — открытый. Над воздушным мешком вертикально размещенного яйца прорезают окошко размером 1×1 см и осторожно снимают часть хорион-алантоисной оболочки над телом эмбриона. Потом глазным пинцетом, минимально травмируя ткани, захватывают амнион и подтягивают его вверх. После этого амнион перехватывают пинцетом с плоскими браншами левой рукой, а правой с помощью туберкулинового шприца вводят исследуемый материал. После заражения эмбриона отверстие в скорлупе закрывают стерильной полиэтиленовой пленкой или часовым стеклом с помощью парафина.
Второй способ заражения — закрытый. Заражение проводят с помощью овоскопа в затемненном боксе. Материал вводят через прокол в скорлупе в участке тупого конца вертикально размещенного яйца. При этом иглу направляют на «темный глаз» эмбриона, отклоняя ее от центральной оси яйца, или, если есть прокол над воздушным мешком, делают прокол и на боковой поверхности горизонтально размещенного яйца и вводят иглу в направлении к телу эмбриона. Если материал введен правильно, тень эмбриона смещается. Отверстия закрывают.
Заражение в хорион-алантоисную оболочку. Первый способ заражения такой. Над воздушным мешком вертикально размещенного яйца вырезают кусочек скорлупы (окошко), потом отслаивают оболочку под скорлупой, обнажая участок хорион-алантоисной оболочки, на который наносят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе запаивают расплавленным парафином. Описанный способ технически простой, но можно повреждить хорион-алантоисную оболочку, потому лучше проводить заражение иным способом.
Второй способ заключается в создании искусственного воздушного мешка на боковой поверхности яйца в том месте, где хорион-алантоисная оболочка свободна от больших кровеносных сосудов (его помечают карандашом). Для этого в обозначенном участке скорлупы выпиливают щель длиной 6 — 8 мм и в ширину 2 мм так, чтобы оболочка под скорлупой осталась невредимой. На тупом конце яйца над естественным воздушным мешком делают прокол.
На обнаженную оболочку под скорлупой наносят каплю стерильного изотонического раствора натрий хлорида (комнатной температуры) и через нее делают в оболочке разрыв с помощью пера для взятия крови или специальной иглой с загнутым концом. Разрывать оболочку под скорлупой надо осторожно, чтобы не травмировать хорион-алантоисную оболочку, которая плотно прилегает к ней. Во время разрыва оболочки под скорлупой капля изотонического раствора попадает внутрь, поскольку хорион-алантоисная оболочка отслаивается и опускается, формируя новый воздушный мешок, его размеры увеличивают, отсасывая воздух резиновой грушей сквозь прокол на тупом конце яйца. Образования искусственного воздушного мешка контролируют с помощью овоскопа.
На хорион-алантоисную оболочку воздушного мешка наносят исследуемый материал, равномерно распределяют по ней, отверстие заливают парафином. Прокол на тупом конце яйца закрывают парафином. Яйца инкубируют так, чтобы искусственный воздушный мешок очутился сверху.
Заражение в желточный мешок. Яйцо кладут на подставку горизонтально так, чтобы тело эмбриона было внизу, а желток — над ним. Иглой для внутримышечных инъекций в скорлупе делают прокол в участке воздушного мешка (глубина проникновения — 2/3 длины иглы) по центральной оси яйца, шприцем вводят исследуемый материал. Отверстие закрывают парафином.
После заражения эмбрионы инкубируют в термостате, размещая их тупым концом кверху. Температура и длительность инкубации зависят от биологических свойств вируса.
Далее проводят вскрытие куриных эмбрионов.
Показателем поражения эмбриона вирусом является его гибель в характерные для вируса сроки, а также патологоанатомические изменения, которые появляются в разных структурах эмбриона. Например, ХАО может иметь отек, кровоизлияния, узлы. Такие изменения наблюдаются при поражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауэски и др. Сам зародыш при этом может отставать в росте и развитии, то есть появляется феномен карликовости. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Например, набрякшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона является признаком размножения в нем вируса гепатита гусей.
Встречаются такие вирусы (например, штамм В1 вируса Ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибель, ни патологоанатомические изменения. Выявить такой вирус возможно только при постановке реакции гемагглютинации.
Иногда при вскрытии эмбриона не удается выявить признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пассаж называют «слепым». Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации – склеиванию эритроцитов.
В качестве исследуемого материала при геамагглютинации используют аллантоисную и амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куриного эмбриона, Перед постановкой реакции испытуемый материал освобождается от крупных частиц ценртифугированием.
Компоненты РГА: вирусосодержащий материал, взвесь эритроцитов человека или животных, физиологический раствор.
Техника постановки РГА. РГА можно ставить двумя методами: капельным методом на стекле и в пробирках или лунках пластин.
Для постановки капельной реакции на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю вируссодержащего материала, тщательно перемешивают пипеткой. При положительной реакции через 1-2 минуты макроскопически обнаруживают появление агглютинации эритроцитов в виде хлопьев.
Постановка РГА в пробирках. В штативе устанавливают 10-12 пробирок, в которых готовят последовательные разведения вируса. Затем во все пробирки вносят по 1 мл 1% взвеси эритроцитов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют для инкубации. При наличии гемагглютинирующего вируса в исследуемом материале агглютинированные эритроциты осядут на дно пробирки в виде зонтика с неровными зубчатыми краями. При отрицательной РГА эритроциты оседают на дно в виде точки с ровными гладкими краями.
Кроме прямой реакции гемагглютинации применяют реакцию непрямой гемагглютинации или реакцию торможения гемагглютинации. Последняя позволяет еще и идентифицировать вирус.

43. Индикация активного вируса: методы, живые системы, признаки положительной биопробы. Примеры.

В вирусологических исследованиях лабораторных животных использовали раньше и используют сегодня с разными целями:
— для непосредственного выделения вирусов из окружающей среды;
— для выявления (индикации) вируса в патологическом материале, то есть для проведения биологической пробы;
— для накопления вирусов в значительном количестве;
— для поддержания вирусов в активном состоянии;
— для титрования вирусов, то есть установления их концентрации в патологическом материале;
— для применения их в качестве индикатора свободного вируса при постановке реакции биологической нейтрализации;
— для получения вакцин и гипериммунных сывороток;
— для оценки эффективности профилактических и лечебных средств;
— для изучения проявления вирусной инфекции на всех стадиях болезни, то есть патогенеза заболевания на уровне организма;
— для исследования иммунного ответа организма на поражение вирусом.
В организме экспериментально пораженных животных обычно вирус накапливается, что может быть использовано в дальнейшем для его исследования. Для выделения вирусов пригодны лишь те животные, в которых заражение привело к четким клиническим проявлениям инфекции, патоморфологических изменений или и гибели. Издавна лабораторных животных используют для индикации вирусов в патологическом материале, то есть для постановки биопробы.
С этой целью суспензией патологического материала заражают лабораторных животных и затем учитывают реакцию. Примером могут служить типичные симптомы поражения верхних дыхательных путей опытных животных, которые могут индуцироваться как аденовирусами, так и ортомиксовирусами, парамиксо-, герпес-, риновирусами. Однако бывают случаи, когда биопроба сопровождается характерными клиническими проявлениями, которые являются специфическими для конкретного заболевания. В таком случае можно сделать вывод не только о наличии вируса, но и о его видовой принадлежности.
Лабораторных животных также применяют в качестве индикатора свободного вируса при постановке реакции биологической нейтрализации.
В лабораториях часто является нужным поддержание вирусов в течение многих лет в активном состоянии. Для этого используются пассажи в разных живых системах, в том числе и лабораторных животных. При любом способе консервирования вирусы с той или другой скоростью теряют свою активность. Новый пассаж позволяет ее возобновить. Под пассажем понимают заражение чувствительного животного с целью получения от нее новой популяции вируса.
Преимущества и недостатки применения лабораторных животных.
— Сравнивая их с двумя другими экспериментальными модельными объектами вирусологических исследований, а именно куриными эмбрионами и культурами клеток, следует заметить, что содержание животных в течение эксперимента (закупка, кормление и др.) являются относительно дорогими.
— Кроме того, животные более трудоемки в работе, при экспериментах на животных не так быстро получаются результаты опытов.
— Также существует опасность инфицирования обслуживающего персонала
и создание аварийных ситуаций (укусы, царапины).
Вместе с этим, во многих видах лабораторных исследований лабораторные животные, как и раньше, играют главную роль. Так, для некоторых вирусов человека, например вируса гепатита В, используются приматы, поскольку для данного вируса неизвестны примеры репликации ни в организме других животных, ни в культуре клеток. При изучении онкогенных вирусов широко используются хомячки, поскольку они являются высокочувствительными к данным вирусам, которые легко вызывают образование опухолей в этих модельных объектах, что позволяет получить соответствующие антисыворотки. Новорожденные мыши используются для выделения вирусов Коксаки и исследование арбовирусов. Кроме этого, эксперименты по изучению механизмов патогенеза и роли иммунного ответа могут быть проведены лишь на лабораторных животных. Наконец, в связи с чрезвычайно широким приложением в вирусологии серологических методов исследования, лабораторные животные (особенно кролики, мыши, крысы и приматы) интенсивно используются для получения диагностических антисывороток.
В вирусологической практике куриные эмбрионы используют по большей части для выделения вирусов из клинического и секционного материала, культивирования лабораторных штаммов возбудителей, приготовления диагностических препаратов и первично-трипсинизированной культуры клеток, а также для получения вакцин.
Для выделения вирусов применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 12-14 дней. При этом возраст эмбрионов, способ их заражения и сроки получения максимального количества вирусов (время инкубации) зависят от биологических особенностей культивируемых вирусов и их тропизма.
Показателями индикации активного вируса в организме куриного эмбриона является его гибель в характерные для вируса сроки, а также патологоанатомические изменения, которые появляются в разных структурах эмбриона. Например, ХАО может иметь отек, кровоизлияния, узлы. Такие изменения наблюдаются при поражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауэски и др. Сам зародыш при этом может отставать в росте и развитии, то есть появляется феномен карликовости. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Например, набрякшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона является признаком размножения в нем вируса гепатита гусей.
Встречаются такие вирусы (например, штамм В1 вируса Ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибель, ни патологоанатомические изменения. Выявить такой вирус возможно только при постановке реакции гемагглютинации или иммуноферментного анализа.
Иногда при вскрытии эмбриона не удается выявить признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пассаж называют «слепым». Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации – склеиванию эритроцитов.
В современных отраслях биотехнологии излюбленным тест-объектом для культивирования вирусов являются клеточные культуры, использующиеся для:
1. Первичного выделения вирусов с окружающей среды или из патологического материала;
2. Накопления вирусов (например, при изготовлении вакцин и диагностикумов);
3. Поддержания штаммов вирусов в лабораторных условиях;
4. Определения инфекционного титра вирусов;
5. Изучения динамики взаимодействия вирусов и клеток;
6. Идентификации вирусов;
7. Как тест-объект в реакции нейтрализации;
8. Изучения действия антивирусных веществ.
Список типов клеток, которые в настоящее время возможно культивировать, достаточно большой. Это элементы соединительной ткани (фибробласты), скелетные ткани (кости и хрящи), скелетные, сердечные, но гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почки), клетки нервной системы (глиальные клетки и нейроны, хотя последние не имеют способности к пролиферации), эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоцит и много разных типов клеток опухолей.
Классификация клеток, которые культивируются in vitro, связана из определенными трудностями. В последнее время термин «культура ткани» превратился на общее понятие, которое включает в себя как органную культуру, в которой наибольшие фрагменты ткани или целые эмбриональные органы эксплантируются с сохранением тканевой архитектуры, так и культуры клеток, ткани которых диспергируются механически, ферментативным или путем спонтанной миграции клеток из экспланта, и клетки, присоединившиеся к субстрату, размножаются в виде суспензии или монослоя.
Органная культура (культура тканей) сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение длительного периода сохраняет гистологическое и биохимическое дифференцирование и после начальной травмы остается, как правило, в нерастущем равновесном состоянии в течение нескольких суток и даже недель. Эти культуры не всегда способны к размножению.
Культуры клеток, напротив, лишенные структурной организации, теряют характерную гистологическую архитектуру и связанные с ней биохимические признаки и, как правило, не достигают равновесного состояния при отсутствии специфических условий. Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток и их разделения на идентичные параллели.
Принцип метода однослойных культур клеток заключается в выращивании клеток, полученных, как правило, путем ферментативной дезинтеграции на стеклянной поверхности в виде монослоя, и базируется на явлении адгезии — способности клеток прикрепляться к стеклянной поверхности. К однослойным культурам относят первичные, или первично-трипсинизированные, диплоидные, гетероплоидные и перевиваемые культуры клеток.
В культуре клеток обнаруживают цитопатическое действие вирусов – это морфологические изменения, которые возникают во время взаимодействия вируса и клетки. Период развития и характер цитопатических изменений, вызванных цитопатогенными вирусами в инфицированных культурах клеток, определяются: 1) свойством вируса, 2) дозой вируса; 3) свойствами клеток и условиями их культивирования.
Характерные для каждого вируса цитопатические изменения развиваются в культурах клеток, зараженных средними дозами вируса, — 1 000-10 000 ЦПД50 (ЦПД50-цитопатическая доза вируса, которая приводит к дегенерации в 50 % пробирок с зараженной культурой клеток). Если дозы вируса большие или малые, морфологические изменения в клетках бывают нетипичными: значительные дозы вирусов вызывают развитие некроза с полным отслаиванием разрушенных клеток от стекла, а незначительные – медленную очаговую дегенерацию клеток.
Выделяют 3 основных вида изменений в случае заражения культур клеток:
1. Образование многоядерных гигантских клеток, синцитиев и симпластов, представляющих результат слияния цитоплазмы многих клеток и амитотического деления.
2. Круглоклеточная дегенерация (пикноз, сморщивание, деструкция клеток), которая возникает в результате разрушения межклеточных связей.
3. Развитие ячеек клеточной пролиферации, которые состоят из нескольких слоев клеток.
Степень дегенерации клеток оценивают знаком «плюс»: (4+) -деструкция всех клеток (100%); (3+) — большинства клеток (75%); (2+) — половины клеток (50%).
Размножение некоторых вирусов (энтеровирусов, арбовирусов, миксовирусов и др.) в культуре клеток можно выявить методом бляшек. В основе метода лежит появление в монослое зараженных клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков (бляшек). Бляшки представляют собой деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться в отличие от живых клеток.
Также проводят реакцию гемагглютинации – способность склеивания эритроцитов в присутствии вируса. В качестве исследуемого материала используют культуральную жидкость инфицированных клеток.
Кроме гемагглютинации применяют реакцию гемадсорбции. Сущность реакции гемадсорбции состоит в том, что на поверхности клеток, инфицированных вирусами, обладающими гемадсорбирующей активностью, адсорбируются эритроциты. Реакция гемадсорбции применяется при диагностике гриппа, парагриппа, клещевого энцефалита, оспы.
Заражение клеточных культур цитопатогенным вирусом ведет к подавлению их метаболизма. Последнее можно определить колориметрическим методом (цветной пробой). Свежая питательная среда pH 7,4-7,8, содержащая феноловый красный, имеет красный цвет. Растущие клетки в процессе метаболизма продуцируют кислоту, что приводит к изменению цвета питательной среды на желтый. При заражении вирусом клетки погибают раньше, чем вырабатывают достаточное количество кислоты, чтобы изменить цвет среды на желтый. Таким образом красный цвет среды указывает на размножение вируса, желтый – на отсутствие вируса.

44. Методы индикации вирионов вирусов при различных вирусных болезнях. Достоинства и недостатки. Характеристика электронной микрофотографии.

К методам индикации вирионов вирусов относятся микроскопические методы исследования.
При световой микроскопии можно увидеть лишь крупные вирусы, размеры которых находятся в пределах разрешающей способности микроскопа – не менее 0,2 мкм, а также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях.
Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию.
Крупные вирусы выявляют путём окраски по Морозову (серебрением). Для выявления внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну.
Люминесцентная микроскопия. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение.
Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными флюорохромными красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии.
Электронная микроскопия — единственный метод экспресс-диагностики, который дает возможность визуально обнаруживать вирусы в клиническом материале независимо от их размеров. С помощью электронной микроскопии можно выявить вирусы в пробах, идентифицировать их по морфологии и дать ответ в течение нескольких часов (преимущество метода). Но, это возможно, если содержимое вирусных частей в 1 мл материала составляет 105-106 и больше (недостаток). Несмотря на то, что метод является высокочувствительным (преимущество), к недостаткам метода относят, в первую очередь, необходимость достаточного вакуума для получения относительно хорошего разрешения, отсутствие возможности просмотра больших образцов, достижение атомного разрешения в критических для поверхности условиях, когда энергия пучка электронов достигает величины до 300 КэВ.
Строение электронного микроскопа. Электронный микроскоп состоит из вертикальной колонны, в которой размещены электронная пушка и система электромагнитных линз, и пульта управления. Внутри колонны создается вакуум 1,3×103-1,3×104 кПа (10-4-10-5 мм рт. ст.).
Пучок электронов словно просвечивает объект, взаимодействуя с атомами его веществ. При этом электроны отклоняются от начальных траекторий и попадают в магнитное поле линзы объектива. Разные участки объекта, в зависимости от их плотности, а также пленка-подложка, на которой размещен объект, рассеивают электроны неодинаково. Чем более плотные участки, тем больше их рассеивающая способность, следовательно, тем темнее будет их изображение на экране. Линза объектива, важнейшая часть электронного микроскопа, формирует первичное увеличенное изображение объекта.
В колонне микроскопа, ниже от линзы объектива, размещена промежуточная линза, предназначенная для получения второго увеличения объекта. И, наконец, следующая после нее проекционная линза создает окончательное увеличение изображения объекта, видимое на флюоресцирующем экране электронного микроскопа.
Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Каплю суспензии вирусов или иммунных комплексов наносят тонко оттянутой пастеровской пипеткой на предметную сетку с опорной пленкой-подложкой. В течение 30-60 с вирусные частицы адсорбируются на гидрофильной колодиевой пленке-подложке. Лишнюю влагу удаляют фильтровальной бумагой. Потом эту процедуру повторяют для концентрирования вируса на пленке-подложке.
Негативное контрастирование электронно-микроскопических препаратов осуществляют 2 % раствором ФВК фосфорно-вольфрамовой кислоты непосредственно на пленке-подложке. Каплю ФВК наносят па предметную сетку с препаратом на несколько секунд (10с). Излишек контрастирующего вещества снимают фильтровальной бумагой.
Суть негативного контрастирования заключается в том, что контрастирующее вещество (ФВК или ее соли) обволакивает вирусные частицы, проникает в их гидрофильные участки, замещая воду, и делает вирионы электронно-плотными, четко определяя при этом их структуру. Контрастирующее вещество непроницаемо для электронного пучка, который легко проходит сквозь органический материал. Вирусные части кажутся светлыми на темном фоне.
Исследования в электронном микроскопе проводят при инструментальном увеличении в 30000-60000 раз. Пересматривают не менее 5 — 10 полей предметной сетки. Диагностически важным является только позитивный результат.
Кроме метода негативного контрастирования используют метод напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла.

45. Тельца-включения: характеристика, методы индикации, роль данного метода в диагностике бешенства.

Характерным для ЦПД многих вирусов является формирование внутриядерных и цитоплазматических включений. Для их обнаружения культуры клеток выращивают на специальных стеклянных пластинках, помещенных в стерильные пробирки с 2 мл клеточной суспензии. После образования монослоя клетки заражают вирусом и через определенные сроки в зависимости от свойств исследуемого вируса готовят препараты. Динамика формирования включений, их форма, размер, субклеточная организация, наличие в них вирусоспецифических нуклеиновых кислот и белков имеют важное диагностическое значение, поскольку отличаются у вирусов разных таксономических групп.
Включение можно выявить в окрашенных или обработанных флюорохромами препаратах.
Их классифицируют по локализации в клетке, содержанию нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности (гомогенные или зернистые). Тельца-включения локализуются избирательно. Одни – в цитоплазме (при оспе (тельца Гварниери), бешенстве (тельца Бабеша-Негре), гриппе, парагриппе, чуме крупного рогатого скота), другие – в ядре (при ринотрахеите крупного рогатого скота, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции, герпесвирусной инфекции (тельца Каудри)). По отношению к красителям включения делят на базофильные (красятся основными красителями – азур, пироксин) и ацидофильные (красятся кислыми красителями – эозин, кислый фуксин). По своей природе включения могут быть местами образования вирусных частиц (фабрики вирионов – тельца Гварниери), накоплением вирусов (тельца Бабеша — Негре), глыбками хроматина (тельца Каудри).
Просмотр зараженных вирусом клеток проводят под малым увеличением микроскопа. Вирусные внутриклеточные включения окрашивают по Туревичу, Муромцеву и Гимзе-Романовскому. Особенно важным данный метод является для вируса бешенства.
Окраска телец Бабеша-Негри по Туревичу. Препараты из срезов гиппокампа при бешенстве в течение 2 мин окрашивают вначале железным гематоксилином, а затем промывают водой. Докрашивают 1%-м водным раствором кислого фуксина 1 мин и снова промывают водой. На последнем этапе препараты обрабатывают смесью из равных частей насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 95%-го спирта, быстро промывают, высушивают и на несколько секунд погружают в абсолютный спирт, вновь высушивают и микроскопируют.
Окраска телец Бабеша-Негри по Муромцеву. Из растертых в ступке кусочков гиппокампа делают обычные мазки. Фиксируют их метиловым спиртом или ацетоном в течение 1-2 ч, промывают водой; затем 5-10 мин окрашивают разведенным 1 : 50 красителем Мансона (2 г метиленового синего, 5 г буры и 100 мл дистиллированной воды), после чего переносят в 10%-й раствор танина до получения бледно-голубой окраски, промывают водой, высушивают; несколько секунд обрабатывают абсолютным спиртом, высушивают и микроскопируют.
Тельца Бабеша-Негри по Туревичу окрашиваются в вишнево-красный цвет с черными зернами внутри, а цитоплазма нервных клеток, в которых они находятся в светло-желтый; по Муромцеву — в бледно-фиолетовый, а цитоплазма клеток — в синий.
Окраска мазков по Гимзе-Романовскому. Осуществляется смесью азур-эозин-метиленового синего после их фиксации в метиловом (5 мин), этиловом (10-15 мин) спиртах или в смеси Никифорова (10-15 мин). Окрашивание длится от 20-30 мин до 1 ч. Ядра клеток окрашиваются в пурпурно-красный цвет, цитоплазма — в синий, а вирусные включения — в разные цвета и оттенки. В частности, тельца Бабеша-Негри — в красный.

46. Титрование вируса по инфекционной активности. ЭД50 вируса, методика титрования и статистическая обработка результатов титрования (метод Кербера).

Этот метод является универсальным для всех живых систем. Количество вируса (титр вируса) при этом измеряется в эффективной 50% дозе – ЭД50.
1 ЭД50 = доза вируса, способная вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных тест-объектов.
Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект — лабораторные животные (обычно белые мыши), куриные эмбрионы или культура клеток. Инфекционный эффект или действие вируса на разных тест-системах может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. У лабораторных животных и куриных эмбрионов действие вируса оценивается в летальной и инфекционной дозах:
1 ЛД50 — доза вируса, убивающая 50% лабораторных животных;
I ЭЛД50 — доза вируса, убивающая 50% куриных эмбрионов;
1 ИД50 — доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50% зараженных лабораторных животных;
1 ЭИД50 — доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куриных эмбрионов.
В культуре клеток действие вируса оценивается по цитопатическому эффекту или действию (ЦПД):
1 ЦПД50 — доза вируса, вызывающая цитопатический эффект в 50% пробирок с зараженной культурой клеток.
Количество ЭД50 (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, будет выражением титра вируса в этом материале. Так, запись Т = 103.48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждом 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103.48 доз, каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50% пробирок с культурой клеток.
Метод титрования вирусов по 50% инфекционному действию пригоден для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую тест-систему. Недостатком является трудоемкость, длительность и необходимость статистического расчета.
Методика определения титра вируса в единицах 50% инфекционного действия (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) заключается в том, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала. Это и будет титр вируса.
Для проведения титрования из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 1:10, т.е. 10-1 до 1:10.000.000, т. е. 10-7, и более (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 и т.д.). Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса, их нужно готовить столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разведение уже не давало бы инфекционного эффекта. Инфекционное действие вируса (величина инфекционного эффекта) с каждым разведением убывает пропорционально логарифму разведения (или дозы). То есть при разведении 1:100 (10-2) инфекционное действие уменьшается в два раза, если 1:1000 (10-3) в три раза и т. д.
Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном одинаковом объеме заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры тканей). При этом учитывают тропизм и дозы вируса, общепринятые для данного способа введения материала. В каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т. к. при меньшем количестве статистическая обработка материала будет иметь слишком большую погрешность.
Однако, при определении титра вируса очень трудно подобрать такие разведения, чтобы одно из них в точности вызывало бы гибель 50% зараженных животных. Часто при титровании количество живых и павших животных бывает неравным. В этом случае для более точного определения титра широко используют в вирусологии метод, предложенный Ридом и Менчем или Кербером.
Расчет дозы вируса, которая дает 50%-ный эффект по Керберу:
lg ЕД50 = lg D + lgd/2 – lgd Σ (r/n),
де D – наибольшее разведение вируса, которое еще дает 100% эффект; d – коэффициент разведения; Σ (r/n) – сумма отношений положительно реагирующих тест-объектов к зараженным для всех разведений, что дают эффект от 0 до 100%; r – количество положительно реагирующих тест-объектов на каждое разведение; n – количество зараженных тест-объектов на каждое разведение.

47. Титрование вируса по гемагглютинирующей активности. ГАЕ вируса, методика титрования и определение титра вируса.

В основе агллютинации лежит взаимодействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эритроцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не одну молекулу гемагглютинина, образующего шиловидные выступы, при достаточно высокой концентрации вируса формируются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.
Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или пробирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритроциты образуют компактный осадок на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномерно. Эта реакция исключительно удобна для количественного определения вируса.
Для постановки гемагглютинации определенное количество эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет затем инкубируют 30—45 мин при комнатной температуре без перемешивания. По результатам реакции можно определить, при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемагглютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирующее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая единица.
Таким образом, зная, какое разведение вируса соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в частности от объема реакционной смеси и концентрации эритроцитов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях может иметь свои особенности.
Постановка реакции.
1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физиологическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную лунку с физиологическим раствором.
2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет 45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.
В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации, что можно использовать для приблизительного расчета титра вируса.
Более экономным методом определения титра является микровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в микропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1%-ной суспензии.

48. Получение вторичного патматериала при лабораторной диагностике. Изоляция вируса, живые системы, признаки репродукции.

При изоляции (выделении) вируса из патологического материала проводят не менее трех слепых пассажей, делается биопроба: у лабораторных животных – клиника, гибель, пат.изменения, у куриных эмбрионов – гибель, пат. изменения, РГА, в культуре клеток – ЦПД, РГАд, метод бляшек.
Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса при заражении лабораторных животных, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительных серологических реакций.
Показателем поражения эмбриона вирусом является его гибель в характерные для вируса сроки, а также патологоанатомические изменения, которые появляются в разных структурах эмбриона. Например, ХАО может иметь отек, кровоизлияния, узлы. Такие изменения наблюдаются при поражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауэски и др. Сам зародыш при этом может отставать в росте и развитии, то есть появляется феномен карликовости. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Например, набрякшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона является признаком размножения в нем вируса гепатита гусей.
Встречаются такие вирусы (например, штамм В1 вируса Ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибель, ни патологоанатомические изменения. Выявить такой вирус возможно только при постановке реакции гемагглютинации или иммуноферментного анализа.
Иногда при вскрытии эмбриона не удается выявить признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пассаж называют «слепым». Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации – склеиванию эритроцитов.
В культуре клеток обнаруживают цитопатическое действие вирусов – это морфологические изменения, которые возникают во время взаимодействия вируса и клетки. Период развития и характер цитопатических изменений, вызванных цитопатогенными вирусами в инфицированных культурах клеток, определяются: 1) свойством вируса, 2) дозой вируса; 3) свойствами клеток и условиями их культивирования.
Выделяют 3 основных вида изменений в случае заражения культур клеток:
1. Образование многоядерных гигантских клеток, синцитиев и симпластов, представляющих результат слияния цитоплазмы многих клеток и амитотического деления.
2. Круглоклеточная дегенерация (пикноз, сморщивание, деструкция клеток), которая возникает в результате разрушения межклеточных связей.
3. Развитие ячеек клеточной пролиферации, которые состоят из нескольких слоев клеток.
Степень дегенерации клеток оценивают знаком «плюс»: (4+) -деструкция всех клеток (100%); (3+) — большинства клеток (75%); (2+) — половины клеток (50%).
Характерным для ЦПД многих вирусов является формирование внутриядерных и цитоплазматических включений. Динамика их формирования, их форма, размер, субклеточная организация, наличие в них вирусоспецифических нуклеиновых кислот и белков имеют важное диагностическое значение, поскольку отличаются у вирусов разных таксономических групп.
Включение можно выявить в окрашенных или обработанных флюорохромами препаратах. Просмотр зараженных вирусом клеток проводят под малым увеличением микроскопа.
Размножение некоторых вирусов (энтеровирусов, арбовирусов, миксовирусов и др.) в культуре клеток можно выявить методом бляшек. В основе метода лежит появление в монослое зараженных клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков (бляшек). Бляшки представляют собой деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться в отличие от живых клеток.
Также проводят реакцию гемагглютинации – способность склеивания эритроцитов в присутствии вируса. В качестве исследуемого материала при геамагглютинации используют аллантоисную и амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куриного эмбриона, взвеси и экстракты из органов животных, а также культуральную жидкость инфицированных клеток.
Кроме гемагглютинации применяют реакцию гемадсорбции. Сущность реакции гемадсорбции состоит в том, что на поверхности клеток, инфицированных вирусами, обладающими гемадсорбирующей активностью, адсорбируются эритроциты. Реакция гемадсорбции применяется при диагностики гриппа, парагриппа, клещевого энцефалита, оспы.
Заражение клеточных культур цитопатогенным вирусом ведет к подавлению их метаболизма. Последнее можно определить колориметрическим методом (цветной пробой). Свежая питательная среда pH 7,4-7,8, содержащая феноловый красный, имеет красный цвет. Растущие клетки в процессе метаболизма продуцируют кислоту, что приводит к изменению цвета питательной среды на желтый. При заражении вирусом клетки погибают раньше, чем вырабатывают достаточное количество кислоты, чтобы изменить цвет среды на желтый. Таким образом красный цвет среды указывает на размножение вируса, желтый – на отсутствие вируса.

49. Идентификация выделенного вируса, определение, методы, РДП, принцип, задачи, компоненты, достоинства и недостатки

Идентификация вируса, т.е. установление его родовой и видовой принадлежности осуществляется с помощью иммунологических методов, включающих следующие реакции: торможения гемагглютинации, задержки гемадсорбции, связывания комплемента, нейтрализации, реакция диффузионной преципитации.
Преципитация (от лат. Praecipitatio – резкое падение вниз) — осаждение, реакция осаждения комплекса антигена с антителом; одна из иммунологических реакций, что позволяют определить содержание антител в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также иммунизированных животных.
Главный принцип реакции: при взаимодействии растворимого антигена с антителом в присутствии электролитов (NaCl) образуется комплекс Аг-Ат в виде нерастворимого преципитата.
РДП позволяет решить следующие диагностические задачи:
— обнаружить и идентифицировать неизвестный выделенный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами);
— обнаружить и определить титр антител в сыворотках с помощью известного антигена.
Достоинства РДП: простота техники постановки; быстрота получения ответа; не требует стерильной работы, особой чистоты компонентов; возможность документирования результата путем фотографирования. Недостаток РДП — низкая чувствительность.
Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер.
В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.
Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5—3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены (вируссодержащий материал), а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат в виде белой полосы. В многокомпонентных системах между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ — пересекаются.
При радиальной иммунодиффузии (по методу Манчини) иммунную сыворотку вносят в агар. Антиген (вируссодержащий материал), помещенный в лунки, диффундирует через агар, и, в результате преципитации с иммунной сывороткой вокруг лунок, образуются непрозрачные кольца, внешний диаметр которых пропорционален концентрации антигена.
Для проведения имменоэлектрофореза:
Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку.
Через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности.
В канавку вносят специфическую иммунную сыворотку.
Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются линии преципитации.
50. Серологические реакции как метод идентификации выделенного вируса: принцип, компоненты, учет результатов. РИФ: принцип, варианты, задачи, компоненты, достоинства и недостатки.

Cерологические методы базируются на реакции «антиген — антитело» и позволяют выявить и идентифицировать вирусы в сыворотке крови с помощью реакций преципитации, агглютинации, иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа и др.
Важно правильно выбирать серологическую реакцию. Каждая лаборатория предпочитает те или иные методы, основываясь на чувствительности, специфичности, скорости, удобствах и стоимости. Так, если вирус выделили на культуре клеток и он дает гемадсорбцию, то проще и быстрее его идентифицировать в РТГАд. Например, вирус ПГ-3 крупного рогатого скота дает гемадсорбцию с эритроцитами морской свинки и может быть идентифицирован в РТГАд. Вирусы, обладающие гемагглютинирующей активностью, целесообразно идентифицировать в РТГА.
В зависимости от природы антигена иммуноглобулины могут вызывать разные эффекты, а именно осуществлять такие реакции:
Агглютинацию — склеивание корпускулярных антигенов с образованием оседающих агрегатов;
Преципитацию — связывание растворимых антигенов с образованием преципитата, который состоит из мелкодисперсных, некоторое время не оседающих агрегатов;
Нейтрализацию биологической активности возбудителей;
Реакцию связывания комплемента (по классическому пути), которая происходит при участии антител за счет присоединения компонентов комплемента к комплексу «антиген — антитело», что ускоряет элиминацию антигена путем фагоцитоза или лизиса.
Реакцию иммунофлюоресценции (РИФ). Она применяется для определения антигенов. Метод базируется на том, что иммуноглобулины способны необратимо связываться с флюоресцентными красителями (флюорохромами) без потери активности и способности связывать антигены. Иммунные комплексы, которые образовались при связывании антигенов мечеными антителами обнаруживают с помощью люминисцентного микроскопа. При облучении коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим) происходит специфическое люминисцентное свечение, например, изотиоционат флюоресцеина дает зелено-желтую окраску. Хотя методы иммунофлюоресценции относительно сложны по сравнению с другими, они имеют значительные преимущества, а именно: позволяют быстро определять разнообразные антигены в очень малом количестве; на одном предметном стекле можно выявить антитела к нескольким разным антигенам; при выявлении тканевых и внутриклеточных антигенов можно установить их локализацию.
Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.
Существует несколько вариантов РИФ: метод прямой флюоресценции, метод непрямой флюоресценции, непрямой флюоресцентный метод со связыванием комплемента.
Метод прямой флюоресценции используют при наличии меченых флюорохромом антител к определенному антигену. Раствор меченых Ig наносят на препарат, который содержит антигены (фиксированные вирусные частицы). Проводят инкубацию, после чего отмывают препарат от избытка антител, а дальше обнаруживают связанные антигеном антитела с помощью люминисцентного микроскопа.
Метод непрямой флюоресценции предусматривает наличие меченых флюорохромом антииммуноглобулиновых антител (антитела к антителам), которые могут присоединяться к Fc-фрагментам антител диагностической сыворотки, которые уже специфически связались с антигенами. Антииммуноглобулиновые антитела получают путем иммунизации коз или баранов кроличьими диагностическими сыворотками. Сначала препараты антигенов обрабатывают растворами разных диагностических сывороток (немеченые антитела), а после инкубации и отмывки избыточного количества антител препараты заливают раствором антииммуноглобулиновых антител, меченых флюорохромом. Свечения обнаруживают только в том препарате, где состоялось специфическое связывание антигена с антителами диагностической сыворотки. Непрямая иммунофлюоресценция в сравнении с прямым методом имеет преимущество в том, что не требует наличия большого количества меченых антител к разным антигенам. С помощью непрямой иммунофлюоресценции можно проводить серологическую диагностику инфекционных заболеваний, обнаруживая антигены или антитела в сыворотке больных.
Преимущество имунофлуоресцентного анализа по сравнению с другими
методами заключается в исследовании внутриклеточной локализации возбудителя.

51. Определение серотипа вируса ящура в РСК. Принцип, задачи, компоненты, учет результатов.

Принцип реакции заключается во взаимодействии между антигеном и антителом в присутствии комплемента. Реакцию СК часто применяют в ветеринарии для обнаружения и идентификации антигена вируса ящура.
Компоненты реакции: испытуемые антигены из эпизоотических штаммов вируса от заболевших животных; сыворотки морских свинок, гипериммунизированных стандартными типовыми и вариантными штаммами вируса ящура (биофабричного производства); антигены контрольные — из типовых и вариантных штаммов вируса ящура (биофабричного производства); комплемент — свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок; гемолизин биофабричного производства; эритроциты барана — в виде 2%-ной взвеси на физиологическом растворе; 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде; набор специфических сывороток и антигенов к другим вирусам, вызывающим везикулярные поражения.
При исследовании материала от свиней в РСК включают специфические антигены и сыворотки к вирусу везикулярной болезни свиней.
РСК ставят в различных объемах: в общем объеме 1 мл — берут 0,2 мл каждого компонента, в общем объеме 0,5 мл — берут 0,1 мл каждого компонента или микрометодом — общий объем 0,125 мл, мри этом каждый компонент равен 0,025 мл.
Приготовление антигена вируса ящура. Стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физиологическим раствором pH 7,4—7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стерильным битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, к которой добавляют двойное по отношению к массе афт количество физиологического раствора (pH 7,4—7,6), т. е. на 1 г афт —2 мл раствора. Полученную 33%-ную суспензию экстрагируют при комнатной температуре 2 ч, промораживают при минус 10 — 20 °С в течение 5 — 18 ч. После размораживания центрифугируют 15—30 мин при 3000—5000 мин-1. Надосадочную жидкость инактивируют при 58 °С 40 мин. После инактивации, если в жидкости остаются хлопья, ее центрифугируют повторно 10—15 мин при 3000 мин-1 и затем используют в качестве антигена в РСК.
Этапы постановки РСК.
1. Титрование гемолизина. Проводят при получении новой серии по общепринятой методике. В главный опыт берут гемолизин в 4-кратной концентрации от его предельного титра (рабочее разведение).
2. Приготовление гемолитической системы (гемсистемы). Для этого смешивают гемолизин в рабочем разведении с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана.
3. Титрование комплемента. Проводят в гемолитической системе в день постановки главного опыта по общепринятой методике. Для главного опыта РСК комплемент берут с излишком в 1 % от его титра в гемсистеме. Правильно взятая рабочая доза комплемента — непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.
4. Приготовление рабочего разведения типоспецифических сывороток. В главный опыт для определения типа вируса ящура сыворотки используют в удвоенном титре (от предельного титра), например, если предельный титр сыворотки составляет 1 : 40, то рабочий титр будет 1 : 20.
5. Приготовление рабочего разведения типоспецифических антигенов. Антигены также используют в удвоенных титрах, например. если предельный титр равен 1 : 6, то рабочий титр будет 1 : 3.
6. Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным (33%-ная взвесь) и в разведениях 1:2, 1 : 4 и 1:8.
7. Постановка главного опыта для определения типа вируса ящура. Одновременно с главным опытом ставят контроль всех специфических ящурных антигенов и сывороток согласно схеме. Компоненты разливают в следующем порядке: 1) специфические сыворотки в рабочем титре по 0,2 мл для каждой сыворотки — один ряд пробирок по вертикали; 2) специфические антигены в рабочем титре по 0,2 мл — в первые семь рядов по горизонтали, для каждого антигена один ряд; 3) испытуемый антиген в разведениях по 0,2 мл — для каждого разведения один ряд пробирок по горизонтали; 4) физиологический раствор по 0,2 мл — в последний ряд по горизонтали (контроль сывороток) вместо антигена и в последний ряд по вертикали (контроль антигенов) вместо сывороток; 5) комплемент по 0,2 мл и рабочем разведении — во все пробирки главного опыта. Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин при 37—38 °С; 6) во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы. Пробирки снова встряхивают и помещают в возимую баню на 30 мин при 37 — 38 °С.
Учет реакции ведут через 5— 10 мин после водяной бани, и окончательный результат получают через 10—12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: (++++) — 100%-ная задержка гемолиза; (+++) — 75%-ная; (++) — 50%-ная; (+) — 25%-ная задержка гемолиза; (—) — полный гемолиз.
Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция будет положительной; если же гомологичные антитела отсутствуют, реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.
При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном.
Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разведениях.
Когда доставленного из хозяйства вирусного материала недостаточно для исследования в РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3—6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. На проведение такой работы необходимо разрешение вышестоящих ветеринарных органов и наличие в диагностической лаборатории условий строгого санитарного режима. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1—0,2 мл, морским свинкам — внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2—0,5 мл. За животными наблюдают 5—7 дней.
В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2—3 «слепых» пассажа. Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.

52. Современные методы идентификации вирусов на примере ИФА: принцип, варианты, задачи, компоненты, учет результатов.

Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также -галактозидазу и -лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.
Выделяют ИФА прямого, непрямого, конкурентного и сэндвич-типа.
При прямом варианте ИФА лунки микроплат покрывают тестирующим антигеном, инкубируют, потом излишек антигена удаляют и добавляют вирусспецифическое антитело, конъюгированное с ферментом. После инкубации излишек конъюгата удаляют и добавляют субстрат (хромоген). Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена. Метод требует минимального количества операций, незначительной затраты реагентов и легко может быть автоматизирован.
При непрямом варианте ферментную метку вводят не в антивирусные иммуноглобулины, а в антитела к ним. Иммунный комплекс Аг-Ат, иммобилизованный на твердом носителе инкубируют с антивидовыми антителами, которые имеют ферментную метку Ат2-Ф.
Главное преимущество метода — простота подготовки реагентов. Исключается сложная процедура подготовки сыворотки — очистка, выделение IgG и связывание их с ферментом; возможно использование неочищенного вирусного препарата.
При использовании сэндвич-метода или его модификации на твердую подложку последовательно будут сорбировать первичные антитела, исследуемый антиген и вторичные антитела. В случае простого варианта сэндвич-метода ферментная метка вводится в состав вторичных антител, а при модифицированном методе – вторичные антитела проявляются комплементарными к ним антивидовыми энзим-меченными (ЭМ) иммуноглобулинами (конъюгатом). Сэндвич-метод с использованием поликлональных антител проводят в три стадии инкубации и несколько стадий отмывки. Однако, при использовании моноклональных антител, специфических к разнообразным участкам антигена, число стадий инкубаций и промываний можно сократить. В последнее время эта модификация находит все более широкое применение, так как для постановки реакции нет необходимости получать специфические для каждого конкрентного случая ЭМ антитела.
Главными преимуществами метода ИФА является то, что с его помощью можно измерять растворимые антигены. Для этого не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала. Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии.

53. Методы индикации и идентификации гемагглютинирующих вирусов. РГА, РТГА, принцип, задачи, компоненты, учет результатов.

Для изучения гемагглютинирующих вирусов в вирусологической практике широко используются реакции прямой гемагглютинации и ее торможения. Причем, если первая применяется только для индикации, то вторая – для идентификации вируса.
Реакция гемагглютинации
Возможность использовать эритроциты разнообразных животных в качестве индикаторов, которые позволяют обнаруживать разные антигены или
антитела, была продемонстрирована в 1902р Краузом и Людвигом.
Позже было показано, что много вирусов проявляют гемагглютинирующие свойства, например, ортомиксовирус, парамиксовирусы, рабдовирус, поксвирусы, реовирус, аденовирусы, и другие. Кроме того, было выявлено, что вирусы агглютинируют не только эритроциты кур, но и других видов птиц и млекопитающих (цыплят, уток, голубей, чаек, морских свинок, собак, человека).
Принцип реакции гемагглютинации заключается в том, что агглютинация происходит за счет адсорбции вирусных частиц на поверхностных рецепторах эритроцитов разнообразных видов животных (без участия в реакции специфических антисывороток). Это свойство предопределено взаимодействием поверхностных вирусных белков, которые получили название гемагглютинина, с поверхностными белками эритроцитов (гликопротеинами). В результате такой адсорбции эритроциты склеиваются друг с другом, что приводит к образованию агрегата, который оседает на дно пробирки или лунки планшета тонкой пленкой в виде перевернутого зонтика (полная агглютинация). Если же реакция не состоялась, то есть в растворе отсутствуют гемагглютинирующий вирус, то эритроциты оседают на дно плотным осадком.
Реакция гемагглютинации (РГА) широко применяется в вирусологической практике как быстрый, технически простой, дешевый и достаточно надежный метод выявления гемаглютинуючих вирусов в исследуемом материале, а также для титрования вирусов.
Постановка реакции состоит из приготовления двукратных разведений вируса на физрастворе и добавления к каждому разведению равного объема взвеси эритроцитов. В контроле вместо разведения вируса используют физраствор. Планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Через определенное время экспозиции учитывают результаты. За положительный результат принимают агглютинацию эритроцитов (визуально – их свободное размещение по дну лунки), а за отрицательный — компактное оседание эритроцитов в виде диска на дно лунки. Положительную реакцию оценивают плюсами от одного до трех соответственно, по интенсивности агглютинации.
То наибольшее разведение вируссодержащего материала, с которым агглютинация оценивается не меньше, чем на два плюса (что отвечает приблизительно 50 % агглютинируемых эритроцитов), содержит 1 гемагглютинирующую единицу (1 ГАЕ).
Реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА или РЗГА). Принцип реакции РТГА заключается в том, что блокированный антителами вирус не может агглютинировать эритроциты. Преимущества РТГА — специфичность, простота техники, скорость, метод не требует стерильности. Недостатки — реакция возможна только с гемагглютинирующими вирусами.
Постановку реакции проводят в два этапа. На первом этапе готовят рабочую дозу антигену (например, для вируса гриппа — 4ГАЕ), проверяют ее правильность с помощью РГА. Эта процедура необходима и потому, что чем низший титр вируса, взятого для РГА, тем меньшие концентрации антител он обнаруживает. Титр в 4ГАЕ – самый низкий, что позволяет получать достоверную гемагглютинацию.
Второй этап — готовят серию разведений сыворотки в одинаковых объемах в лунках планшета (от 1:10 до 1:1280). На точность выявление титра антител влияет кратность разведений сыворотки.
К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем вирусу в титре 4ГАЕ. Смесь выдерживают определенное время при определенной температуре. В каждую лунку с Аг и Ат добавляют равный объем 1% взвеси эритроцитов. Следовательно, в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации — на отсутствие вируса в смеси. Отсутствие свободного вируса в смеси вирус+сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса. Другими словами, если в сыворотке есть специфические антитела, то вирус теряет способность агглютинировать эритроциты и агглютинация отсутствует (задерживается).
Титром антител считают то наибольшее разведение сыворотки, которое дает полную задержку гемагглютинации.

54. Эритроцитарные диагностикумы в диагностике вирусных инфекций:название, этапы производства, в какой реакции используются, принцип реакции, задачи, компоненты, учет результатов.

Эритроцитарные диагностикумы используются в реакции непрямой гемагглютинации.
Она основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).
Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс-агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк — реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы: фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.; обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела). Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем: к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном; смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С; учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста. РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.
РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи: обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума; обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

55. Эталонная серологическая реакция в диагностике вирусных болезней: принцип, задачи, компоненты, учет результатов, достоинства и недостатки.

Универсальной реакцией, которая служит эталоном при оценке других серологических реакций является реакция нейтрализации вируса.
Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не связавшегося с антителами) вируса является чувствительная к вирусу живая система: животные, куриные эмбрионы или культура клеток.
При постановке реакции в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С) в течение одного часа или 16—18 ч (зависит от вируса и условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов и через соответствующий срок (в зависимости от вируса) учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:
1) гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений в органах и тканях лабораторных животных;
2) гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;
3) цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в культуре клеток.
Сыворотки, используемые в PH, должны быть предварительно освобождены от термолабильных неспецифических ингибиторов путем прогревания. Как чувствительную систему, так и метод ее заражения подбирают с учетом наилучшей возможности культивирования данного вируса.
Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное количество антител, а один из этих компонентов все еще неизвестен, то PH можно ставить в двух вариантах:
1) к разным дозам (разведениям) сыворотки (обычно в виде последовательных 2-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы вируса (обычно 100—1000 ЕД50). В этом варианте определяют титр вируснейтрализующих антител в сыворотке, показателем которого служит разведение сыворотки, защищающее от действия вируса 50 % зараженных биологических систем;
2) к разным дозам (разведениям) вируса (обычно в виде последовательных 10-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы сыворотки (обычно в разведениях 1 : 10 или 1 : 20). При постановке данного варианта PH кроме исследуемой (или специфической) сыворотки используют и нормальную (отрицательную) сыворотку. В этом случае определяют индекс нейтрализации (IN), который показывает, во сколько раз иммунная (специфическая) или исследуемая сыворотка снижает титр вируса по сравнению е нормальной сывороткой.
Необходимо помнить, что любая серологическая реакция (в том числе и PH) должна сопровождаться контролями на каждый компонент, участвующий в реакции.
PH позволяет решить следующие диагностические задачи:
обнаружить и определить титр вируснейтрализующих антител с помощью известного вируса;
идентифицировать неизвестный (выделенный) вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами).
Достоинствами PH являются ее универсальность и высокая специфичность; недостатки — большая трудоемкость; необходимость строго соблюдать стерильность материалов, посуды и инструментов; высокая стоимость живых биологических систем; относительная длительность биопробы и необходимость проведения математических расчетов.

56. Определение индекса нейтрализации в РН: цель, принцип, компоненты, учет и статистическая обработка результатов.
Индекс нейтрализации – это кол-во инфекц. доз вируса, нейтрализованного сывороткой, по сравнению с контролем.
При расчете индекса нейтрализации разведения суспензии вируса соединяют с равными объемами неразведенной иммунной или неразведенной контрольной сывороток. Индекс нейтрализации представляет собой отношение титра вируса в ЛД50 в смеси с контрольной сывороткой к титру вируса в ЛД50 в смеси с неразведенной иммунной сывороткой. Для нахождения индекса из логарифма титра ЛД50 в присутствии контрольной сыворотки вычитают логарифм титра ЛД50 вируса в присутствии иммунной сыворотки. Расчет IN ведут по формуле: lgIN = lgT1-lgT2, где Т1 — титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Т2 — титр вируса в присутствии гипериммунной сыворотки. Индекс выражают либо логарифмом количества ЛД50, нейтрализуемого обследуемой сывороткой, либо соответствующим антилогарифмом, обозначающим его количество арифметически.

57. Методы индикации и идентификации гемадсорбирующих вирусов. РГАд, РТГАд, принцип, задачи, компоненты, учет результатов.

Гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы: орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы. Эти же вирусы обладают спосодностью вызывать гемагглютинацию – склеивание эритроцитов. Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 (I) группы. По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно.
Техника постановки реакции гемадсорбции
Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с заражённой культурой вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависит от вида вируса. Пробирки встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания неадсорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малом увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.
При добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также (реже) с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.
Методика постановки РТГАд заключается в следующем: на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу сыворотки в разведении 1:10; пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами); во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки; через 30 мин — учет результатов. Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса в культуре клеток.
58. ПЦР: принцип, задачи, компоненты, достоинства и недостатки, учет результатов.
Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.
Суть метода — амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин—тимин и гуанин—цитозин.
ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер — это фрагмент ДНК, состоящий из 20—30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.
Обычно ПЦР ставят в 25—40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый — денатурация при 92—95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй — отжиг, или присоединение праймеров при 50—65 °С; третий — элонгация, или полимеризация при 68—72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25—40 циклов насинтезировать миллионы (2n) фрагментов ДНК — количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.
Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1—2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1—2 рабочих дня.
С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.
В настоящее время внедряется новая технология ПЦР—ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность — мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20—60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце — блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’—3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода — проблема контаминации ампликонами.
Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.
Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.
ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.

59. Этапы ПЦР-анализа: цель, методика и компоненты каждого этапа.
60. Амплификация: принцип, компоненты, оборудование

Суть метода ПЦР — амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин—тимин и гуанин—цитозин.
ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер — это фрагмент ДНК, состоящий из 20—30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.
Обычно ПЦР ставят в 25—40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый — денатурация при 92—95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй — отжиг, или присоединение праймеров при 50—65 °С; третий — элонгация, или полимеризация при 68—72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25—40 циклов насинтезировать миллионы (2n) фрагментов ДНК — количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.
Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1—2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1—2 рабочих дня.
С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.

61. Доказательство этиологической роли выделенного вируса как этап лабораторной диагностики вирусных болезней: исследуемый материал, методы, учет результатов.

В некоторых случаях после выделения вируса требуется доказать его роль в данной вспышке заболевания.
Обычно это касается тех вирусов, которые могут находиться в организме животного, и если нет никаких предрасполагающих и осложняющих факторов, не вызывающих болезнь (например, некоторые штаммы энтеровирусов, вирус ПГ-3 крупного рогатого скота, аденовирусы и др.).
Этиологическая роль может быть доказанной, если в парных сыворотках от животных, послуживших источником получения патологического материала, будет установлено нарастание титра антител к выделенному вирусу. Иногда для доказательства этиологической роли в заболевании животных выделенного вируса пытаются воспроизвести это заболевание на здоровых животных (обычно молодняке) того же вида путем заражения их этим выделенным вирусом. Однако недостаток этого метода, кроме дороговизны, еще в том, что далеко не всегда гарантирует воспроизведение болезни (например, ПГ-3, аденоинфекцию и др.).

62. Ретроспективная диагностика как этап лабораторной диагностики вирусных болезней: исследуемый материал, методы, учет результатов.
В диагностике вирусных болезней ретроспективная диагностика играет очень важную роль. Существуют обстоятельства, при которых практически невозможно выделить вирус, или когда вирус принадлежит к трудноизолируемым из патологического материала (некоторые тога-, буньявирусы и др.). При проведении ретроспективной диагностики применяют серологические методы. Для этой цели исследуют парные сыворотки крови больных животных, для получения которых от каждого животного кровь для исследования на наличие специфических антител берут дважды с интервалом в 2—3 нед: в начале заболевания (в острой фазе) и в конце его (в период выздоровления — реконвалесценции). Чтобы сыворотки были стерильными, берут кровь и получают из нее сыворотку в асептических условиях. Парные сыворотки крови обычно берут не менее чем от 10—20 животных и исследуют их одновременно.

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!:

четыре × три =

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.

Adblock detector